呂曉平，郭利靜，李寧，魏月*，杜海英

1. 河北農(nóng)業(yè)大學理工學院（滄州 061100）；2. 河北省農(nóng)產(chǎn)品加工工程技術(shù)研究中心（保定 071000）；3. 河北省農(nóng)林科學院棉花研究所（石家莊 050051）

有機磷農(nóng)藥（Organophosphorus pesticide，OPs）是目前使用較為廣泛的一類農(nóng)藥[1]，OPs中毒事件時有發(fā)生，2016年GB 2763—2016對各種常見農(nóng)藥的最大殘留量做出了明確規(guī)定。當前常見的有機磷農(nóng)藥檢測方法主要有高效液相色譜法[2]、氣相色譜法[3]、酶聯(lián)免疫法[4]、酶抑制法[5]等，這些檢測技術(shù)各有優(yōu)缺點[6]。生物傳感器檢測技術(shù)因其快速、高效、低成本等優(yōu)點，在有機磷農(nóng)藥殘留的檢測中被廣泛地應用[7]。近年來，應用乙酰膽堿酯酶生物傳感器檢測有機磷農(nóng)藥殘留的研究尤為突出[8]，文章詳細總結(jié)了這方面的研究成果。

1 乙酰膽堿酯酶生物傳感器的工作原理及其研究進展

1.1 乙酰膽堿酯酶生物傳感器的工作原理

乙酰膽堿酯酶生物傳感器是利用乙酰膽堿酯酶作為識別和催化元件，乙酰膽堿酯酶與有機磷農(nóng)藥發(fā)生酶促反應，反應產(chǎn)物是一種電活性物質(zhì)，該電活性物質(zhì)與基體電極產(chǎn)生響應，基體電極使化學信號轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?，從而完成對有機磷農(nóng)藥殘留量的測定[9-10]。

1.2 乙酰膽堿酯酶生物傳感器的研究進展

乙酰膽堿酯酶生物傳感器的電極材料、酶的固定化研究以及酯酶本身的活性是相關(guān)研究的主要內(nèi)容[11-12]。

1.2.1 電極材料

生物膜電極是乙酰膽堿酯酶生物傳感器的核心部分。納米材料由于優(yōu)良的導電性、高靈敏度、響應時間短等特點成為理想的電極材料[13-14]。乙酰膽堿酯酶生物傳感器中常用的納米材料有金[15]、銀[16-17]、碳[18]、復合材料[19]等，這些生物傳感器對馬拉硫磷、對氧磷、毒死蜱、敵敵畏等有機磷農(nóng)藥的檢測準確度有較大幅度的提高，具體數(shù)據(jù)見表1。

表1 不同電極材料的乙酰膽堿酯酶生物傳感器對有機磷農(nóng)藥殘留量的檢測限

接表1

1.2.2 酶的固定化方法

酶的固定化技術(shù)是利用載體將天然游離的酶束縛或限制在一定的空間中，保留其催化活性，是一種常用、便捷、有效的生物酶的修飾手段[20-21]。乙酰膽堿酯酶的固定包括將酯酶固定在酶膜上以及將酶膜固定在電極上兩個過程，酶的最終固定結(jié)果將直接影響到檢測的準確度、靈敏度以及響應時間，因此酶的固定化技術(shù)一直是近幾年生物傳感器研究的熱點[22-23]。常見的酶的固定化方法包括物理吸附法、包埋法、共價鍵交聯(lián)法等[24-25]。

1.2.2.1 物理吸附法

物理吸附法是最簡單且不改變酶性質(zhì)的方法，但這種方法利用酶與載體之間的弱作用力，易發(fā)生酶的脫吸附，不便于操作和保存[26]。Saleemd等[27]使用物理吸附法將乙酰膽堿酯酶固定在介孔硅的納米通道上，該方法在較苛刻的條件下熱穩(wěn)定性能達到90 ℃，能重復使用3個周期，具有較高的實用價值。

但該方法最終僅能保留50%的酶活性，不便于乙酰膽堿酯酶的固有催化活性的保持，另外該方法在操作上有一定的難度。因此延長酶的保存期、提高酶的活性，是物理吸附法突破的關(guān)鍵。

1.2.2.2 包埋法

包埋法是將酶包埋在高聚物的細微凝膠網(wǎng)格或高分子半透明膜內(nèi)的固定化方法[28]。Itoh等[29]將酶包埋在雜化介孔二氧化硅膜（F127-MST）中，成功制備了乙酰膽堿酯酶生物傳感器的單元，將該單元用于檢測敵敵畏、對硫磷等有機磷農(nóng)藥，檢測限高于普通乙酰膽堿酯酶生物傳感器，且穩(wěn)定性和重復性都得到很大提高。

目前，該方法的不足體現(xiàn)在酶的催化速率較快的情況下反應產(chǎn)物累積較多，無法快速及時地釋放到反應的溶劑中，影響反應速率嚴重時會造成膜材料的破裂。

1.2.2.3 共價交聯(lián)法

共價交聯(lián)法是將酶與載體通過共價鍵的相互作用固定到一起，此方法中最常用的交聯(lián)劑是戊二醛[30]。Rui等[31]將AChe和牛血清蛋白（BSA）通過靜電吸附作用，將其依次吸附在NH2-SBA-15表面，再加入戊二醛使AChe的氨基交聯(lián)。在最佳固定化條件下，相對于游離AChE，固定化AChE（AChE-NH2-SBA-15）的比活性達到約95%，固定效率約為95%。

從以上實驗數(shù)據(jù)中可得知，與物理吸附法和包埋法相比較，共價交聯(lián)法更具優(yōu)勢。

1.2.3 乙酰膽堿酯酶活性的篩選

孫霞等[32]的研究結(jié)果表明鴨血清中的AChE酶含量豐富，對常見的有機磷農(nóng)藥較敏感，且來源廣泛、廉價易得，是用于乙酰膽堿酯酶生物傳感器上較理想的一種。

2 乙酰膽堿酯酶生物傳感器的展望

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)、材料和化工等方面研究的不斷發(fā)展，乙酰膽堿酯酶生物傳感器正在由粗放到精細、由笨重向便捷化方向發(fā)展。乙酰膽堿酯酶生物傳感器較常規(guī)的檢測手段在準確度、響應時間、靈敏度等方面有較大的優(yōu)勢。然而，不可否認的是目前的乙酰膽堿酯酶生物傳感器尚存許多亟待突破解決的問題[33-34]。

2.1 減少固定化酶過程中酶活力的損失

在固定化乙酰膽堿酯酶的過程中，化學試劑的使用使得很大一部分酶的活性降低甚至失去活性，這就造成了資源和資金的浪費，固定化酶的活性與重復利用周期由載體的特性與結(jié)構(gòu)決定，如該材料的生物相容性與親水性等[35-36]。因此，新型酶固定化材料的研究是未來固定化技術(shù)研究的一大重點。

2.2 提高酶的復活率、提升酶的穩(wěn)定性

乙酰膽堿酯酶生物傳感器中所使用的乙酰膽堿酯酶電極大多為一次性消耗品，無法重復使用，這就造成了每測定一種樣品就要更換一次乙酰膽堿酯酶電極，不但增加了酶生物傳感器的資金投入，而且還限制了生物傳感器的自動化發(fā)展。如果能提高乙酰膽堿酯酶的復活率，使其可重復使用[37]，如Lan等[38]研發(fā)的基于金屬螯合親和固定化甲基對硫磷水解酶（Mph）光學生物傳感器裝置，用于有機磷化合物的檢測，可以抑制酶活性的不可逆性，提高酶的抗干擾能力。如果合理利用該原理固定化乙酰膽堿酯酶，那么將大幅度提高酶的復活率、提升酶的穩(wěn)定性。

2.3 向多酶化方向發(fā)展

因為酶特有的專一性和特異性，使得一種乙酰膽堿酯酶生物傳感器只能測定出一種或一類有機磷農(nóng)藥[39]，而不能同時測定多種有機磷農(nóng)藥，這就給樣品中各種有機磷農(nóng)藥的測定造成了困擾，因此多酶生物傳感器檢測多種農(nóng)藥是未來發(fā)展的一種趨勢。

2.4 向微型、便捷化方向發(fā)展

傳統(tǒng)的乙酰膽堿酯酶生物傳感器體積都比較大，這就給野外作業(yè)或在其它比較復雜的環(huán)境下的檢測造成了一定的困擾，因此微型化、便捷化也是生物傳感器必然的發(fā)展方向[40]，如Mishra等[41]發(fā)明的可穿戴的手套生物傳感器以及Guo等[42]發(fā)明的視覺篩選卡測定有機磷農(nóng)藥等方法就為未來生物傳感器檢測有機磷農(nóng)藥的研究提供了方向。

3 結(jié)語

綜上所述，從乙酰膽堿酯酶生物傳感器的新型電極材料、幾類常用的酶的固定化方法、酶活性的篩選等方面闡述了乙酰膽堿酯酶生物傳感器的研究成果以及存在的不足之處。

近年來，隨著科技的進步與創(chuàng)新，有機磷農(nóng)藥的檢測技術(shù)也在不斷更新，乙酰膽堿酯酶生物傳感器也已成為快速檢驗樣品中有機磷農(nóng)藥的一種技術(shù)手段，為有機磷農(nóng)藥的快速檢測提供了新方向。為現(xiàn)場檢測和分析有機磷農(nóng)藥的小型、便攜式、有不同固定化酶、可用于樣品中多元混合物的分析與鑒別的乙酰膽堿酯酶生物傳感器仍然是有機磷農(nóng)藥檢測領(lǐng)域的一個重要發(fā)展趨勢。