梅子龍，陳潤杰，楊錕，王旺，陳歡，龔大春,

1. 三峽大學(xué)湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心（宜昌 443002）；2. 三峽大學(xué)生物催化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（宜昌 443002）

酵素產(chǎn)品含有豐富的酶類、維生素、礦物質(zhì)及多種生物活性成分，不僅可以促進(jìn)機(jī)體正常的新陳代謝、延緩衰老、提供養(yǎng)分、修復(fù)細(xì)胞、凈化血液，還能增強(qiáng)消化功能和營養(yǎng)物質(zhì)吸收功效，在預(yù)防人類疾病方面具有重要意義[1-3]。研究表明，不同發(fā)酵方式對酵素的品質(zhì)有很大影響。李建強(qiáng)等[4]以多種水果為原料，研究了自然發(fā)酵工藝和三級發(fā)酵工藝差別；莫大美等[5]研究了復(fù)合菌對酵素質(zhì)量的影響，結(jié)果顯示在發(fā)酵過程中植入酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等微生物菌對酵素SOD活性有明顯的提高作用。

大球蓋菇是一種利用農(nóng)作物秸稈制作的大型真菌，富含蛋白質(zhì)、多糖、礦質(zhì)元素、維生素等生物活性物質(zhì)，氨基酸含量達(dá)17種，人體必需氨基酸齊全[6]，具有治療或改善人體多種疾病之功效，堪稱是色鮮味美的全營養(yǎng)保健食品。大球蓋菇種植對土壤和氣候要求不高，非常適合精準(zhǔn)扶貧和農(nóng)村農(nóng)作物秸稈資源化利用。隨著大球蓋菇在農(nóng)村地區(qū)大面積推廣，除了鮮食外，如何將其進(jìn)一步深加工為食用酵素產(chǎn)品或者其他儲存期長的產(chǎn)品，將是大球蓋菇產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重點(diǎn)。

為了延長大球蓋菇的產(chǎn)業(yè)鏈，試驗(yàn)研究了3種不同發(fā)酵工藝對大球蓋菇酵素產(chǎn)品的影響，對其發(fā)酵過程清除自由基能力、主要產(chǎn)酶酶活及有機(jī)酸含量進(jìn)行了檢測。此次試驗(yàn)對于大球蓋菇的深加工和大面積推廣具有重要意義。目前這方面研究在國內(nèi)尚未見文獻(xiàn)報道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與試劑

大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata）、酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、德氏乳桿菌保加利亞亞種（Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgaricus）、長雙歧桿菌（Bifidobacterium longum）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）等，均購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心CICC（China Center of Industrial Culture Collection）。

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；蔗糖、乳糖、木糖（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；所有化學(xué)試劑均為分析純。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基成分（g/L）：蔗糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20。

斜面保藏培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20，瓊脂20。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

MX-307冷凍離心機(jī)（天美）；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技）；SX-700 滅菌鍋（上海天美）；UV-1800分光光度計(jì)（日本島津）；自制1 L酵素發(fā)酵罐；5 L上海保興三聯(lián)式發(fā)酵罐；30 L全自動滅菌發(fā)酵罐（德國貝朗）；LC5090高效液相（浙江福立）；等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 3種發(fā)酵方式及主要流程

以大球蓋菇為主要原料，分別采用自然發(fā)酵（1號罐）、酵母菌-德氏乳桿菌保加利亞亞種-嗜熱鏈球菌先后順序接種發(fā)酵（2號罐）、酵母菌-長雙歧桿菌-嗜熱鏈球菌先后順序接種發(fā)酵（3號罐）3種工藝制備大球蓋菇酵素，總時間為110 d。

1號自然發(fā)酵（1號罐）：大球蓋菇原料→清洗，消毒→晾干，切片→裝桶，壓緊→加白糖→常溫發(fā)酵（110 d）→酵素→ 過濾→裝瓶→成品。

2號接種發(fā)酵（2號罐）：大球蓋菇原料→清洗，消毒→晾干，切片→裝桶，壓緊→加白糖→植入酵母菌→常溫發(fā)酵（50 d）→植入德氏乳桿菌保加利亞亞種→45 ℃發(fā)酵（30 d）→植入嗜熱鏈球菌→47 ℃發(fā)酵（30 d）→酵素→過濾→裝瓶→成品。

3號接種發(fā)酵（3號罐）：大球蓋菇原料→清洗，消毒→晾干→裝桶，壓緊→加白糖→植入酵母菌→常溫發(fā)酵（50 d）→植入長雙歧桿菌→40 ℃發(fā)酵（30 d）→植入嗜熱鏈球菌→47 ℃發(fā)酵（30 d）→酵素→過濾→裝瓶→成品。

1.2.2 大球蓋菇酵素DPPH自由基的清除作用[7]

在發(fā)酵過程中定期取樣，發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min離心后，取上清液用于測定。

準(zhǔn)確稱取20 mg DPPH·，用無水乙醇定容于250 mL容量瓶中，得到質(zhì)量濃度為80 μg/mL的DPPH·溶液，將酵素樣品用離心除去固體物質(zhì)。取1 mL測試液及1 mL的80 μg/mL DPPH·混勻后避光反應(yīng)30 min，定容到5 mL。測定波長517 nm下吸光度的變化，對照溶劑用無水乙醇代替，DPPH 自由基清除率（R1）按式（1）計(jì)算。

式中：A1為1 mL DPPH·溶液與1 mL提取液的吸光度；A2為1 mL提取液與1 mL無水乙醇的吸光度；A3為1 mL DPPH·溶液與1 mL無水乙醇的吸光度。

1.2.3 大球蓋菇酵素清除超氧陰離子能力的測定[8]

取4.5 mL pH 8.2的Tris-HCl緩沖液，分別加入4.2 mL蒸餾水和0.3 mL 25 mmol/L鄰苯三酚，混勻后25℃反應(yīng)5 min，立即加入1 mL 8 mol/L的HCl，終止反應(yīng)，定容至25 mL。在波長299 nm處測定吸光度A1；另取4.5 mL緩沖液，蒸餾水定容至25 mL，在波長299 nm處測定吸光度A2；另取4.5 mL緩沖液，加入1 mL酵素測試液、3.2 mL蒸餾水、0.3 mL鄰苯三酚溶液，混勻后25 ℃反應(yīng)5 min，立即加入1 mL 8 mol/L的HCl，終止反應(yīng)，定容至25 mL。在波長299 nm處測定吸光度A3。同上步操作，僅不加鄰苯三酚溶液，測得A4。超氧陰離子清除率（R2）按式（2）計(jì)算。

1.2.4 大球蓋菇酵素清除羥自由基能力的測定[9]

在比色管中依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液、1 mL酵素測試液、1 mL蒸餾水、2 mL 6 mmol/L H2O2溶液，搖勻，靜置10 min，再加入2 mL 6 mmol/L水楊酸溶液，搖勻，靜置30 min后稀釋1倍，再于波長510 nm處測定吸光度A1；用蒸餾水代替水楊酸溶液，測得吸光度A2；用蒸餾水代替酵素測試液，測得吸光度A3。羥自由基清除率（R3）按式（3）計(jì)算。

1.2.5 酵素中自由基清除能力總評價

將3種自由基清除能力進(jìn)行求和，然后平均值，即可得到酵素的自由基清除能力綜合評價值（R）。

1.2.6 蛋白酶活性的測定

采用GB/T 23527—2009[10]的福林法進(jìn)行測定。

1.2.7 纖維素酶活性的測定

采用GB/T 2583—2003[11]的還原糖法測定。

1.2.8 脂肪酶活性的測定

采用GB/T 23535—2009[12]的方法進(jìn)行測定。

1.2.9 淀粉酶活性的測定

具體步驟如下：（1）取試管2批，分別作為供試管和空白管，各精密加入1%淀粉溶液1 mL，置37℃水浴保溫5 min。（2）供試管中精密加入酵素樣品1 mL，37 ℃水浴準(zhǔn)確反應(yīng)5 min后，立即加2 mL DNS試劑，搖勻，沸水浴10 min；空白管中加入2 mL DNS試劑，37 ℃ 水浴反應(yīng)5 min，精密加入酵素樣品1 mL，搖勻，沸水浴10 min。在540 nm處測定吸光度。（3）在上述條件下，每分鐘水解淀粉生成1 μmol麥芽糖的量，為1個淀粉酶活力單位（1 U=1 μ mol/min）。采用張思等[13]的公式計(jì)算淀粉酶活。

1.2.10 總酸的測定

采用GB/T 12456—2008[14]的方法進(jìn)行測定。

1.2.11 有機(jī)酸的測定[15]

樣品處理：取一定體積酵素原液，以8 000 r/min離心5 min，取上清液，適當(dāng)稀釋，過0.22 μm水膜，待用。

色譜條件：色譜柱Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm）；檢測器，紫外檢測器；流動相，5 mmol/L硫酸；檢測波長，210 nm；流速，0.6 mL/min；柱溫，30 ℃；進(jìn)樣量，20 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同發(fā)酵方式對所制得的大球蓋菇酵素DPPH自由基清除能力的影響

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)室初步試驗(yàn)，建立了1.2.1所示的3種發(fā)酵方式，制備出大球蓋菇酵素，每隔1周進(jìn)行一次清除自由能力的測定。圖1所示大球蓋菇酵素分別在7，50和110 d時的DPPH·清除率。從圖1中可以看出，1號自然發(fā)酵工藝所制得的大球蓋菇酵素在起初7 d內(nèi)DPPH·清除率很高，但隨著自然發(fā)酵過程的進(jìn)行，DPPH·清除率有所下降，到110 d時已經(jīng)下降了近40%；而人工接種的2號和3號發(fā)酵工藝，DPPH·清除率相對比較穩(wěn)定，雖然在起初DPPH·清除率低于自然發(fā)酵，但是后期DPPH·清除率高于自然發(fā)酵，2號接種發(fā)酵工藝所制得的大球蓋菇酵素最高。說明人工接種更加有利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。

圖1 不同發(fā)酵方式對大球蓋菇酵素DPPH自由基清除能力的影響

2.2 不同發(fā)酵方式對所制得的大球蓋菇酵素超氧陰離子的清除能力的影響

按照1.2.1所建立的3種發(fā)酵方式進(jìn)行大球蓋菇酵素制備，在不同時間段測得大球蓋菇酵素對超氧陰離子清除能力。如圖2所示，1號自然發(fā)酵工藝制備的大球蓋菇酵素對超氧陰離子清除能力明顯低于人工接種2號和3號發(fā)酵工藝，2號工藝比較穩(wěn)定，3號工藝在后期發(fā)酵略有降低，2種工藝在110 d最終的超氧陰離子清除能力基本一致，在35%左右。從酵素制備工藝控制角度考慮，2號發(fā)酵過程優(yōu)于3號工藝。

圖2 不同發(fā)酵方式對大球蓋菇酵素超氧陰離子清除能力的影響

2.3 不同發(fā)酵方式對所制得的大球蓋菇酵素羥自由基的清除能力的影響

按照1.2.1的方法制得的大球蓋菇酵素進(jìn)行羥自由基清除能力的測定，結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出，3種發(fā)酵工藝所制得的酵素在羥自由基清除能力相差不大，1號自然發(fā)酵工藝所得到的酵素清除羥自由基能力略高，而且3種發(fā)酵工藝所得到的酵素這種清除能力在110 d內(nèi)均相對穩(wěn)定。

圖3 不同發(fā)酵方式對大球蓋菇酵素羥自由基清除能力的影響

2.4 3種發(fā)酵工藝對所制得的大球蓋菇酵素的自由基清除能力的總評價

研究表明，通過3種發(fā)酵工藝試驗(yàn)，所制得的大球蓋菇酵素對DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基3種離子的清除能力有一定的差異。按照1.2.5的方法進(jìn)行綜合評價，結(jié)果見圖4。圖4顯示，人工接種的2種工藝所制得的酵素綜合清除自由基能力比自然發(fā)酵的提高16%左右。其中第2種工藝接種發(fā)酵最高，可以達(dá)到58.3%，說明人工接種的工藝具有較好的開發(fā)潛力。

2.5 不同工藝大球蓋菇酵素蛋白酶活力比較

對按照方法1.2.1制得的大球蓋菇酵素進(jìn)行蛋白酶的分析測定，結(jié)果見圖5。由圖5可知，自然發(fā)酵的蛋白酶活力明顯高于其他2種發(fā)酵方式的蛋白酶活力，先后加入安琪活性干酵母和長雙歧桿菌的蛋白酶活力比先后加入安琪活性干酵母和德氏乳桿菌保加利亞亞種的蛋白酶活力稍高，其活力大小依次為1號自然發(fā)酵工藝＞3號接種發(fā)酵工藝＞2號接種發(fā)酵工藝。其中自然發(fā)酵蛋白酶活力最高，為75.432 U/mL。說明自然富集的菌群產(chǎn)蛋白酶能力強(qiáng)，而人工接種的酵母菌、德氏乳桿菌保加利亞亞種、長雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌產(chǎn)蛋白酶的能力較弱。

圖4 不同發(fā)酵方式對大球蓋菇酵素清除自由基總能力的影響

圖5 不同發(fā)酵工藝對大球蓋菇酵素產(chǎn)品中蛋白酶活力影響

2.6 不同發(fā)酵工藝對大球蓋菇酵素纖維素酶活力的影響

由圖6可知，不同發(fā)酵工藝制得的大球蓋菇纖維酶活力有較大差異。1號自然發(fā)酵工藝制得的大球蓋菇酵素中的纖維素酶活力比其他2種發(fā)酵方式的纖維素酶活力高，3種工藝的酵素纖維素酶活力大小依次為1號自然發(fā)酵＞3號接種發(fā)酵＞2號接種發(fā)酵。這說明自然富集的微生物菌群產(chǎn)纖維素酶的能力強(qiáng)，人工接種的幾種菌株產(chǎn)纖維素酶的能力較弱。

2.7 不同發(fā)酵工藝對大球蓋菇酵素脂肪酶活力比較

由圖7可知，自然發(fā)酵的脂肪酶活力比其他2種發(fā)酵方式的脂肪酶活力低，2種混菌發(fā)酵的脂肪酶活力相差不大，其活力大小依次為2號接種發(fā)酵工藝≈3號接種發(fā)酵工藝＞1號罐，其中人工接種的發(fā)酵工藝的脂肪酶活力最高，為0.40 U/mL，是自然發(fā)酵脂肪酶活力的2倍。說明人工接種的酵母菌和嗜熱鏈球菌對脂肪酶貢獻(xiàn)較大。

圖6 不同發(fā)酵工藝對大球蓋菇酵素產(chǎn)品中纖維素酶的活力影響

圖7 不同發(fā)酵工藝對大球蓋菇酵素產(chǎn)品中脂肪酶活力影響

2.8 不同工藝大球蓋菇酵素淀粉酶活力比較

如圖8所示，不同發(fā)酵罐中的淀粉酶活力均不是很高。自然發(fā)酵的淀粉酶活力比其他2種發(fā)酵方式的淀粉酶活力低，先后加入安琪活性干酵母和長雙歧桿菌的淀粉酶活力比先后加入安琪活性干酵母和德氏乳桿菌保加利亞亞種的淀粉酶活力稍低，其活力大小依次為2號發(fā)酵工藝＞3號發(fā)酵工藝＞1號發(fā)酵工藝。說明無論是自然發(fā)酵還是人工接種發(fā)酵，微生物產(chǎn)淀粉酶的能力均較弱。

圖8 不同發(fā)酵工藝對大球蓋菇酵素產(chǎn)品中淀粉酶活力影響

2.9 不同發(fā)酵工藝大球蓋菇酵素中總酸含量和有機(jī)酸種類的比較

由圖9可知，不同發(fā)酵工藝中酵素的總酸含量存在明顯的差異，其總酸含量大小依次為1號發(fā)酵工藝＞3號發(fā)酵工藝＞2號發(fā)酵工藝。其中自然發(fā)酵的1號工藝總酸最高可達(dá)22.65 g/kg，說明自然發(fā)酵的微生物菌群產(chǎn)酸能力強(qiáng)。而有機(jī)酸種類差別較大。1號工藝罐中的酵素含有大量的乳酸和乙酸；2號工藝罐中的酵素含有較多量的乙酸，另外還有少量的丙酸和微量的丁酸；3號工藝罐中的酵素也含有豐富的乙酸、較少的丙酸、少量的丁酸以及微量的乳酸和甲酸。3個不同工藝制得酵素中均含有豐富的乙酸，而且1號工藝罐中的酵素乳酸含量較高。這些有機(jī)酸可通過降低腸道pH、提高消化酶活性、增殖有益菌、抑制有害菌，從而調(diào)控腸道微生物平衡，起到一定調(diào)節(jié)腸道微生物，改善腸道健康的作用。

圖9 不同發(fā)酵工藝對大球蓋菇酵素產(chǎn)品總酸含量和種類的影響

3 結(jié)論與討論

以大球蓋菇為主要原料，采用自然發(fā)酵、酵母菌-德氏乳桿菌保加利亞亞種-嗜熱鏈球菌先后順序接種發(fā)酵、酵母菌-長雙歧桿菌-嗜熱鏈球菌先后順序接種發(fā)酵3種工藝制備大球蓋菇酵素，并對其發(fā)酵過程中的3種清除自由基能力、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶、淀粉酶和有機(jī)酸進(jìn)行研究。結(jié)果表明，不同發(fā)酵工藝制得的大球蓋菇酵素均有較強(qiáng)的抗氧化性，人工接種2種工藝發(fā)酵制備的酵素工藝更加穩(wěn)定，清除DPPH自由基和超氧陰離子的能力要強(qiáng)于自然發(fā)酵，清除自由基總能力最高的是2號發(fā)酵工藝；人工接種發(fā)酵的脂肪酶和淀粉酶的活力分別提高了100%和85%；并且豐富了酵素中有機(jī)酸的種類。而自然發(fā)酵工藝在蛋白酶、纖維素酶、總酸和乳酸含量方面優(yōu)于人工接種發(fā)酵，但其工藝穩(wěn)定性較差，酵素產(chǎn)品質(zhì)量不容易控制?？傊?，人工接種發(fā)酵工藝所制得酵素產(chǎn)品清除自由基能力、脂肪酶、淀粉酶、有機(jī)酸種類3個方面優(yōu)于自然發(fā)酵，工藝更加穩(wěn)定。這些研究將對大球蓋菇制備成植物酵素的深加工具有重要意義。