查圣華，王俊亮，廉翠翠，楊玉冰，秦迪，張宏

北京同仁堂健康藥業(yè)股份有限公司研發(fā)中心（北京 100085）

水是人體之本，人體中水的含量依其不同發(fā)展階段而有所不同。胎兒體內(nèi)水分約占90%，嬰兒為80%，青壯年為70%，中老年為60%甚至50%，所以人的老年化過程也是一種水分丟失的過程[1]。皮膚是人體最大的器官之一，約占體質(zhì)量的16%。水是保護皮膚清潔、滋潤、細嫩的特效而廉價的美容劑。人體皮膚表層水分在12%～15%時，皮膚光滑而有彈性，一旦缺少水分引起的干燥則嚴重影響肌膚健康。就改善皮膚水分而言，以往主要關注于化妝品，現(xiàn)在對美麗的追求趨向于“由外而內(nèi)”，開始注重內(nèi)部調(diào)節(jié)，“食療”被越來越多人所追求。美容養(yǎng)顏類保健食品成為保健品產(chǎn)業(yè)內(nèi)最大的細分市場之一。傳統(tǒng)的改善皮膚水分并且已被熟知的健康食品有牛奶、蜂蜜、蘋果、獼猴桃、胡蘿卜、玉米、黃瓜、蘆薈、海藻等。而新型的改善皮膚水分功能因子有透明質(zhì)酸、多肽、神經(jīng)酰胺、葡聚糖胺、硫酸軟骨素、大豆異黃酮等[2-7]。

透明質(zhì)酸又名玻璃酸，是一種高分子量的直鏈多糖，廣泛存在于生物體結(jié)締組織中，它是人皮膚表皮及真皮的主要基質(zhì)成分之一，具有明顯的親水特性，可促進水合作用和提高皮膚塑性。存在于表皮中的透明質(zhì)酸，在表皮屏障功能和角質(zhì)層水合作用中起一定作用[8]。透明質(zhì)酸分子鏈之間相互纏繞成連續(xù)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，水分子通過極性鍵和氫鍵與透明質(zhì)酸直接作用，使得透明質(zhì)酸像分子海綿一樣，可吸收和保持其自身重量上千倍的水分，是國際公認最好的保濕劑，有“天然保濕因子”之稱[9]。膠原蛋白是以魚皮為原料，經(jīng)酶解后制成的分子量小、消化吸收率高的膠原低聚肽，膠原低聚肽中含有大量的親水基，使之具有良好的保濕功效，能夠達到保持肌膚潤澤度的目的。膠原低聚肽分子外側(cè)親水基團羧基與羥基等的大量存在，使膠原肽分子極易與水形成氫鍵，因此膠原低聚肽具有良好的保水保濕性能[10]。燕窩是目前廣受消費者歡迎的美容養(yǎng)顏滋補品，研究表明，糖蛋白是燕窩的主要組成成分，也是重要的活性成分之一，使燕窩兼具蛋白質(zhì)與糖類2種特性[11]。糖蛋白中最具價值的是唾液酸，即N-乙?；窠?jīng)氨酸，又名燕窩酸，由一系列9-碳單糖衍生而來，是燕窩中最關鍵的生物活性成分。燕窩中含有一種非常重要的多肽類激素-表皮生長因子（EGF）。Kong等[12]、江潤祥等[13]使用各種生化方法，如測定分子量、競爭結(jié)合化驗、凝膠電泳等，最早發(fā)現(xiàn)燕窩中含有類似表皮生長因子（EGF）活性物質(zhì)，這種物質(zhì)與小鼠體內(nèi)分離出的EGF具有許多相似的物理性質(zhì)。作為蛋白質(zhì)家族中一個重要生長因子，EGF對于在靶細胞中的增殖、分化與存活起著關鍵作用[14]。它能刺激多種細胞的分裂增殖，促進細胞分化，對受損皮膚進行快速修復，促進手術創(chuàng)口和創(chuàng)面愈合；它能影響人體皮膚的細膩和老化，能啟動衰老皮膚細胞，使皮膚變得光滑而有彈性，因此被譽為“美容基因”。雖然這些功能因子具有較好的改善皮膚水分及美容養(yǎng)顏功效，但市場上未見以透明質(zhì)酸、膠原蛋白及燕窩為主要原料配合使用的美容養(yǎng)顏產(chǎn)品。因此，以透明質(zhì)酸、膠原蛋白及燕窩為主要原料，研制一種美容養(yǎng)顏的燕窩保健食品，并對研制樣品改善皮膚水分功效及安全性進行研究，從而為燕窩美容養(yǎng)顏產(chǎn)品開發(fā)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燕窩（馬來西亞PT Swift Marketing Sdn Bhd公司）；透明質(zhì)酸鈉（華熙福瑞達生物醫(yī)藥有限公司）；海洋魚膠原蛋白肽（北京盛美諾生物技術有限公司，以羅非魚魚皮為原料，經(jīng)過清洗、老化、酶解、滅酶、脫色、過濾、精制、除菌過濾、濃縮、保安過濾、噴霧干燥等工藝制備而成，平均分子量≤1 000 μ）；冰糖（河間市太極宮糖業(yè)有限公司）；瓊脂（石獅市環(huán)球瓊膠工業(yè)有限公司）；安慰劑（在包裝、外觀、色澤及口感與研制的透明質(zhì)酸膠原蛋白冰糖燕窩基本保持一致）；試驗用生化試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.2 儀器與設備

離心脫水機（東莞市鑫洪佳通用機械設備有限公司）；安瓿水浴滅菌器（ASMDE-2.5型，山東新華醫(yī)療器械股份有限公司）；皮膚分析儀（SHP88，德國Courage+Khazaka公司）；全自動血液細胞分析儀（BC-5300，邁瑞醫(yī)療國際有限公司）；尿液分析儀（Mission U500，艾康生物技術有限公司）；全自動生化分析儀（Liasys，意大利AMS公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 透明質(zhì)酸膠原蛋白冰糖燕窩生產(chǎn)工藝流程

1.3.2 生產(chǎn)工藝步驟及要點

1) 原料驗收：主要原料透明質(zhì)酸鈉、膠原蛋白、燕窩等按照企業(yè)標準進行驗收；冰糖、瓊脂輔料按照國家標準進行驗收。檢驗合格后，進入10萬級生產(chǎn)潔凈區(qū)。

2) 燕窩泡發(fā)、挑選、清洗：將配方量的燕窩，以10倍量水泡發(fā)，挑選雜質(zhì)，清洗，離心脫水，備用。

3) 透明質(zhì)酸鈉、膠原蛋白溶解：將配方量透明質(zhì)酸鈉加到約25倍量純化水中，攪拌至溶解，經(jīng)300目濾網(wǎng)過濾，備用；將配方量膠原蛋白加到約5倍量純化水中，攪拌至溶解，經(jīng)300目濾網(wǎng)過濾，備用；將配方量冰糖、瓊脂加入到約5倍量純化水中，加熱至溶解，經(jīng)300目濾網(wǎng)過濾，備用。

4) 混合、定量：將透明質(zhì)酸鈉溶液、膠原蛋白溶液與冰糖瓊脂溶液混合均勻，冷卻降溫至30 ℃以下。將凈燕窩與上述混合液加純化水定量，混合20 min。

5) 灌裝：灌裝至清洗過的70 mL玻璃瓶中，控制每瓶凈含量70 g。

6) 滅菌、挑選：將瓶裝產(chǎn)品置水浴滅菌柜中滅菌，121 ℃，20 min。滅菌后挑選剔除鼓蓋品、裂紋品，炸裂品。

7) 外包裝、成品入庫：外包裝后，按規(guī)定隨機抽取每批產(chǎn)品，按照標準所述方法及要求進行檢驗，檢驗合格后成品入庫。

1.3.3 感官評價方法

感官評定由10人（5男5女）經(jīng)過專業(yè)感官評價培訓的評價員組成評價小組，分別對研制樣品進行色澤、氣味、滋味、穩(wěn)定性4個指標進行感官評價。各原料添加量試驗及正交試驗感官評價標準如表1。

表1 感官評定標準

1.4 配方設計研究

以燕窩、透明質(zhì)酸鈉、膠原蛋白為主要原料，冰糖、瓊脂、水為輔料研制一種燕窩保健食品。根據(jù)預試驗及現(xiàn)有工藝設備條件，確定透明質(zhì)酸膠原蛋白冰糖燕窩規(guī)格為每瓶70 g。通過預試驗及各原料添加量單因素試驗確定各原料最佳添加量，并通過對燕窩、膠原蛋白、冰糖粉、瓊脂添加量設計正交試驗，優(yōu)化產(chǎn)品最終配方。

1.4.1 透明質(zhì)酸鈉添加量確定

根據(jù)透明質(zhì)酸鈉在保健食品中的限量要求及參考食品藥品監(jiān)督管理總局相關改善皮膚水分功效保健食品中透明質(zhì)酸鈉起效量，確定每日食用透明質(zhì)酸含量90 mg；因此配方中透明質(zhì)酸鈉含量90 mg/70 g。

1.4.2 膠原蛋白添加量確定

根據(jù)預試驗結(jié)果，確定膠原蛋白添加量為0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 g進行膠原蛋白添加量試驗，分別添加透明質(zhì)酸鈉90 mg，燕窩1.5 g，冰糖粉6 g，瓊脂100 mg，按照1.3.2步驟配置10罐樣品，并按照表1進行感官評定。

1.4.3 燕窩添加量確定

根據(jù)預試驗結(jié)果，確定燕窩添加量為0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 g進行燕窩添加量試驗，添加透明質(zhì)酸鈉90 mg，冰糖粉6 g，以1.4.2確定膠原蛋白最佳添加量，瓊脂100 mg，按照1.3.2的步驟配置10罐樣品，并按照表1進行感官評定。

1.4.4 瓊脂添加量確定

根據(jù)預試驗結(jié)果，確定瓊脂添加量為50，75，100，125和150 mg進行瓊脂添加量試驗，添加透明質(zhì)酸鈉90 mg，冰糖粉6 g，膠原蛋白、燕窩添加量以1.4.2、1.4.3確定添加量。按照1.3.2的步驟配置10罐樣品，并按照表1進行感官評定。

1.4.5 冰糖添加量確定

根據(jù)預試驗結(jié)果，確定冰糖粉添加量為5，6，7，8和9 g進行冰糖粉添加量試驗，透明質(zhì)酸鈉、膠原蛋白、燕窩添加量以1.4.1、1.4.2、1.4.3、1.4.4確定添加量，按照1.3.2的步驟配置10罐樣品，并按照表1進行感官評定。

1.4.6 正交試驗配方優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗結(jié)果確定以燕窩、膠原蛋白、冰糖粉、瓊脂為主要原料，通過四因素三水平試驗模型L9(34)進行配方優(yōu)化，根據(jù)單因素試驗結(jié)果及考慮到產(chǎn)品成本，配方優(yōu)化各原料水平選擇如表2。按照各組試驗配方按照1.3.2步驟各配置10罐樣品，按照表1進行感官評定。

表2 原輔料用量因素水平表

1.5 人體試食方法

1.5.1 受試對象

1.5.1.1 納入標準

經(jīng)體驗合格的自愿受試者。年齡在30～50歲，皮膚水分≤12%。

1.5.1.2 排除標準

年齡有30歲以下或者50歲以上者，妊娠或哺乳期婦女，過敏體質(zhì)及對本品過敏者；合并有心、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴重疾病及內(nèi)分泌疾病，精神病患者；短期內(nèi)服用與受試功能有關的藥品或保健品，影響到對結(jié)果的判斷者；未按規(guī)定服用受試樣品，無法判斷療效或安全性者。

1.5.2 試驗方法

采用組間對照和自身對照設計。將符合納入標準并保證配合試驗的自愿受試者，按受試者的皮膚水分情況隨機分為受試組與對照組。并盡可能考慮影響結(jié)果的主要因素如年齡等，進行均衡性檢驗。試驗采用雙盲法，受試組與對照組均按1 d 1瓶服用透明質(zhì)酸膠原蛋白冰糖燕窩或者安慰劑，連續(xù)30 d。2組受試者在試驗期間停止使用其他口服及外用有關保持皮膚水分的用品。試驗期間不改變原來的飲食習慣，正常飲食。

1.5.3 觀察指標

各項觀察指標于試食試驗開始及結(jié)束時各測定1次。

試驗前詳細詢問受試者健康狀況，了解受試者的精神、睡眠、飲食、大小便等情況，并測量體質(zhì)量、血壓、心率等，對所有受試者進行常規(guī)體格檢查及必要的實驗室檢查。

血常規(guī)：紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)、血紅蛋白含量測定等。

尿常規(guī)：pH、白細胞、尿糖等。

糞便常規(guī)：蟲卵檢查等。

生化指標檢測：血清總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、膽固醇（CHOL）、甘油三酯（TG）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、尿酸（UA）、血糖（GLU）等。

心電圖、腹部B超、胸透等檢查。

皮膚水分測試：有寬敞、通風良好、溫度、濕度等空間環(huán)境穩(wěn)定的檢查室進行，在安靜狀態(tài)下，用潔凈的棉球蘸蒸餾水清潔被測部位，擦干后15 min進行水分的測定，試食前測定工作由同1臺儀器、同1人操作。

1.5.4 結(jié)果判定

1.5.4.1 有效

經(jīng)儀器測定水分得到改善。

1.5.4.2 無效

水分沒有得到顯著改善。

1.6 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，自身配對資料采用配對t檢驗，試驗組和對照組之間在方差齊同的前提下，采用成組t檢驗方差不齊采用秩和檢驗。所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 配方研究試驗結(jié)果

2.1.1 原料添加量及單因素試驗結(jié)果

各原料添加量及單因素試驗按照1.4.1～1.4.5試驗方法進行試驗，并按照表1感官評價標準對各個試驗樣品進行感官評定，其試驗結(jié)果如圖1～圖4。

由圖1～圖4可知，膠原蛋白、燕窩、瓊脂、冰糖添加量對產(chǎn)品感官影響較大。隨著膠原蛋白粉、燕窩、瓊脂及冰糖粉添加，各試驗樣品產(chǎn)品感官均先增加后下降，且在試驗添加量范圍內(nèi)，膠原蛋白添加量1.5 g，燕窩添加量2 g，冰糖粉添加量7 g，瓊脂添加量125 mg時，各試驗樣品感官評分最高。因此通過圖1～圖4試驗結(jié)果，確定以膠原蛋白、燕窩、冰糖粉、瓊脂為原料，設計四因素三水平正交試驗，優(yōu)化產(chǎn)品配方。因為可以通過調(diào)整瓊脂及膠原蛋白添加量增加產(chǎn)品黏稠度，考慮到產(chǎn)品成本，燕窩添加量選用1～2 g進行配方優(yōu)化。

圖1 膠原蛋白添加量對感官影響

圖2 燕窩添加量對感官影響

圖3 瓊脂添加量對感官影響

圖4 冰糖添加量對感官影響

2.1.2 正交試驗結(jié)果

按照表1感官評價標準評價L9(34)的正交試驗中各試驗號樣品感官，其最后得分如表3所示。由表3中的極差分析結(jié)果可知，各因素對試驗樣品的綜合得分影響因素為A＞C＞B＞D；因此燕窩添加量對產(chǎn)品感官影響最大。從感官結(jié)果可知，7號試驗樣品（A3B1C3D2）得分數(shù)最高。極差分析的最佳組合為A3B2C3D2，將這2個組合物做驗證對比試驗，A3B2C3D2組合綜合評分為91.6分，驗證正交試驗理論組合的可靠性，即最佳配方為：燕窩添加量2 g、膠原蛋白添加量1.5 g、瓊脂添加量150 mg，冰糖粉添加量7 g。

2.2 改善皮膚水分功效試驗結(jié)果

2.2.1 試食前后一般情況

初始試驗人群對照組組51例，男/女為32/19，試驗組51例，對照組51例，男/女為32/19。對照組年齡33.98±2.72歲；試驗組年齡34.10±2.90歲。30 d試驗后，試驗組與對照組均無受試者因間斷服用受試品或無法判斷效果被篩除。

2.2.2 安全性指標

2.2.2.1 一般情況

試食期間，受試組未觀察到明顯過敏及其他不良反應，精神、睡眠、飲食、大小便情況良好。

2.2.2.2 體質(zhì)量、血壓、心率、尿常規(guī)、大便常規(guī)、血常規(guī)及生化指標

由表4和表5可知，食用受試物30 d后，試食組和對照組體質(zhì)量、血壓、心率未見明顯異常改變，尿常規(guī)、大便常規(guī)、血常規(guī)及生化指標均在正常范圍內(nèi)，提示透明質(zhì)酸膠原蛋白冰糖燕窩對人體健康無明顯損害。

表3 正交試驗結(jié)果與分析

表4 體質(zhì)量、血壓、心率、尿、大便、血常規(guī)檢測結(jié)果（）

表4 體質(zhì)量、血壓、心率、尿、大便、血常規(guī)檢測結(jié)果（）

試食組試食前 試食后 試食前 試食后體質(zhì)量/kg 61.75±11.89 61.85±11.95 60.04±11.97 59.99±11.71收縮壓/mmHg 111.41±9.05 110.35±8.88 111.39±10.66 109.82±9.18舒張壓/mmHg 68.59±5.42 69.51±6.35 69.65±6.85 69.04±5.81心率/(次·分-1) 77.80±8.81 75.94±9.14 77.84±6.37 77.73±7.66白細胞/(109·L-1) 6.65±1.35 6.65±1.22 6.59±1.42 6.42±1.31紅細胞/(1012·L-1) 4.87±0.46 4.77±0.44 4.83±0.48 4.81±0.44血紅細胞/(g·L-1) 146.33±14.08 140.49±13.66 145.84±26.79 139.71±11.95尿常規(guī) 正常 正常 正常 正常大便常規(guī) 正常 正常 正常 正常指標 對照組

表5 生化指標檢測結(jié)果（）

表5 生化指標檢測結(jié)果（）

指標 對照組試食組試食前 試食后 試食前 試食后血糖/(mmol·L-1) 4.62±0.55 4.59±0.49 4.45±0.39 4.58±0.45甘油三酯/(mmol·L-1) 1.08±0.57 1.38±0.82 1.25±1.08 1.22±0.57膽固醇/(mmol·L-1) 4.00±0.72 4.52±0.87 4.02±0.69 4.23±0.76尿素氮/(mmol·L-1) 5.00±1.14 4.54±1.23 4.68±1.09 4.42±1.15肌酐/(μmol·L-1) 71.75±14.77 68.30±13.71 67.13±13.47 69.64±14.97尿酸/(μ mol·L-1) 316.51±62.09 313.24±67.12 318.25±50.17 316.07±66.59谷丙轉(zhuǎn)氨酶/(U·L-1) 22.99±13.54 20.46±10.57 23.19±15.75 19.23±12.75谷草轉(zhuǎn)氨酶/(U·L-1) 23.57±7.70 21.33±7.79 23.90±9.28 19.77±7.00總蛋白/(g·L-1) 70.31±3.02 70.46±3.95 69.33±2.62 69.81±3.01白蛋白/(g·L-1) 44.87±2.25 44.96±2.60 44.76±2.05 44.31±2.58

2.2.2.3 心電圖、腹部B超、胸透檢查結(jié)果

均在正常范圍內(nèi)。

2.2.3 功效觀察皮膚檢測結(jié)果

由表6所示，試食組的皮膚水分在試食后明顯提高，與試食前比較差異有顯著性差異（p＜0.05），與對照組相比也有顯著性差異（p＜0.05）。最佳配方研制透明質(zhì)酸膠原蛋白冰糖燕窩產(chǎn)品對改善人體皮膚水分有顯著作用，且對身體健康沒有影響。試驗組皮膚含水量平均值由試驗前的8.73±1.10提高到9.65±1.11。

表6 皮膚檢測結(jié)果（）

表6 皮膚檢測結(jié)果（）

組別 皮膚水分試食前 試食后對照組 8.72±1.00 8.76±1.00試食組 8.73±1.10 9.65±1.11*#注: 自身對照*, p＜0.05; 組間對照#, p＜0.05

馮寧等[15]研究口服透明質(zhì)酸對皮膚水分的改善作用及體內(nèi)抗氧化作用，結(jié)果表明，試食組的膚水分明顯提高，與試食前和對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；試食組血清SOD活性與對照組試食后及自身試驗前比較，差異均有統(tǒng)計學意義（p＜0.05）；受試者安全性指標均在正常范圍內(nèi)，口服HA可改善人體皮膚水分，具有體內(nèi)抗氧化作用，且口服安全性高。左紅梅等[16]研究膠原蛋白維E顆粒對皮膚水分改善作用，結(jié)果表明，膠原蛋白維E顆粒能明顯提高皮膚水分，且無任何不良反應。王寧等[17]研究海洋魚膠原低聚肽和透明質(zhì)酸復配對改善女性皮膚水分作用，結(jié)果表明，膠原低聚肽和透明質(zhì)酸復配對改善女性皮膚水分有顯著作用，且對健康沒有影響。Abidin等[18]

將燕窩提取物加到培養(yǎng)兔角膜細胞的血清培養(yǎng)基中，觀察其形態(tài)學變化，RT-PCR方法測定基因表達，試驗證明，燕窩有助于兔角膜的細胞分裂、促進再生，這將有利于角膜損傷治愈過程。研究表明，透明質(zhì)酸、膠原蛋白及燕窩具有改善皮膚水分及美容養(yǎng)顏的功效。試驗結(jié)果表明，以透明質(zhì)酸、膠原蛋白及燕窩為主要原料，研制的燕窩保健食品具有顯著改善皮膚水分功效。因此將透明質(zhì)酸、膠原蛋白與燕窩復配開發(fā)燕窩保健食品豐富美容養(yǎng)顏產(chǎn)品市場，將具有廣闊的市場前景。

3 結(jié)論

以燕窩、透明質(zhì)酸鈉、海洋魚膠原蛋白為主要原料，冰糖、瓊脂、純化水為輔料，研制一種燕窩罐頭食品，其主要工藝包括原料驗收、燕窩泡發(fā)、清洗、混合定量、灌裝、滅菌、包裝檢驗等。通過正交試驗及感官評定，確定產(chǎn)品最佳配方為：每70 g產(chǎn)品含有透明質(zhì)酸鈉90 mg、膠原蛋白1.5 g、燕窩2 g、瓊脂150 mg、冰糖粉7 g，其余為水。此配方研制的透明質(zhì)酸膠原蛋白冰糖燕窩黏稠度合適，產(chǎn)品分散性良好，口感絲滑，甜度合適，具有燕窩特有口感。對最佳配方試驗樣品進行改善皮膚水分功效及安全性研究，將自愿受試者按皮膚水分情況隨機分為試食組和對照組，分別使用透明質(zhì)酸膠原蛋白冰糖燕窩和安慰劑，試驗后結(jié)果表明，試食組皮膚水分在試食后明顯提高，與試食前比較差異有顯著性（p＜0.05）與對照組比較差異也有顯著性（p＜0.05），試驗組皮膚含水量平均值由試驗前的8.73±1.10提高到9.65±1.11。說明該最佳配方透明質(zhì)酸膠原蛋白冰糖燕窩具有改善皮膚水分的功能作用。試食透明質(zhì)酸膠原蛋白冰糖燕窩前后，血常規(guī)、血生化等各項指標均在正常范圍內(nèi)，也未觀察到過敏及其他不良反應。開發(fā)一種風味及功效俱佳的燕窩保健食品，對美容養(yǎng)顏產(chǎn)品開發(fā)提供參考依據(jù)。