劉連成

江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院（淮安 223003）

黑啤酒又稱濃色啤酒，是在普通麥芽原料基礎(chǔ)上加上焦香麥芽和黑色麥芽釀制而成，酒液呈黑褐色，原麥芽汁濃度12～20 °P，酒體突出麥芽焦香味，口味醇厚[1]。洋槐蜜是蜜蜂從洋槐花的花朵中采得的花蜜在蜂巢中釀制的蜜。據(jù)研究分析[2-3]，洋槐蜜含有果糖、葡萄糖、維生素、還原酶等物質(zhì)，還含有黃酮、酚酸等抗氧化物質(zhì)，以及多種無機(jī)鹽和有利于身體健康的微量元素。洋槐蜜黑啤酒是在黑啤酒釀制發(fā)酵過程中，黑麥汁在煮沸回旋冷卻后添加少量的洋槐蜜，以提高黑啤酒的抗菌消炎、養(yǎng)顏和潤腸等保健功能[4]。

高級醇是洋槐蜜黑啤酒發(fā)酵代謝的副產(chǎn)物之一，主要成分是異戊醇，其次為活性戊醇、β-苯乙醇、異丁醇和正丙醇等。高級醇含量超過一定濃度會引起啤酒雜醇臭味和不愉快的苦味，在黑啤酒中含量一般低于100 mg/L，黑啤酒中高級醇含量高，飲用過量會導(dǎo)致上頭，會引起人劇烈頭痛和頭暈[5]，但適量的高級醇能賦予黑啤酒酒體豐滿，口感醇厚柔和。在釀造過程中把高級醇含量控制在合理范圍內(nèi)，同時(shí)控制合適的醇酯比顯得非常重要。啤酒中高級醇和酯類物質(zhì)的形成，受到眾多因素的影響，有酵母菌種、接種量、發(fā)酵溫度、麥汁組成、發(fā)酵壓力和溶氧水平等[6-8]，試驗(yàn)利用學(xué)校啤酒教學(xué)工廠小型啤酒生產(chǎn)線對黑啤酒中高級醇含量影響因素進(jìn)行優(yōu)化研究。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用洋槐蜜黑啤酒：江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院釀造的14 °P洋槐蜜保健黑啤酒。

1.2 儀器與設(shè)備

光電自動菌落計(jì)數(shù)器，江蘇達(dá)康醫(yī)療用品有限公司；M-2型；6820氣相色譜儀：美國Agilent公司；啤酒生產(chǎn)設(shè)備，來自學(xué)院啤酒教學(xué)工廠200 L小型現(xiàn)代啤酒生產(chǎn)設(shè)備（粉碎機(jī)、糖化設(shè)備、發(fā)酵設(shè)備、過濾設(shè)備等），山東中德啤酒設(shè)備有限公司。

1.3 方法

黑啤酒中高級醇及總酯含量測定采用氣相色譜法[9]。

黑啤酒發(fā)酵液中酵母細(xì)胞數(shù)測定采用自動菌落計(jì)數(shù)器法[10]。

黑麥芽中α-氨基氮含量的測定采用茚三酮法[11]。

洋槐蜜黑啤酒的生產(chǎn)：以普通麥芽、焦香麥芽、黑麥芽為原料，按照黑啤酒生產(chǎn)的90∶5∶5的原料比例，二次煮出糖化法進(jìn)行麥汁糖化，酒花為香料，麥汁冷卻入罐時(shí)加少量洋槐蜜，采用下面發(fā)酵工藝生產(chǎn)14 °P洋槐蜜保健黑啤酒。

1.3.1 研究酵母接種量對黑啤酒高級醇含量的影響

洋槐蜜黑啤酒糖化和發(fā)酵工藝同常規(guī)14 °P洋槐蜜黑啤酒生產(chǎn)工藝，下同。采用不同酵母接種量，測定滿罐時(shí)的酵母細(xì)胞數(shù)，研究單因素接種量對洋槐蜜黑啤酒高級醇含量的影響。

1.3.2 研究發(fā)酵壓力對黑啤酒高級醇含量的影響

黑啤酒發(fā)酵工藝采用帶壓發(fā)酵，選擇0.01～0.04 MPa不同主發(fā)酵壓力，后發(fā)酵壓力升至0.1 MPa，發(fā)酵結(jié)束測定高級醇含量。

1.3.3 研究不同α-氨基氮含量的麥汁對黑啤酒高級醇含量的影響

通過添加酵母膏等方式控制黑麥芽汁不同α-氨基氮含量（160～200 mg/L），其他發(fā)酵條件相同，檢測發(fā)酵后黑啤酒高級醇含量。

1.3.4 研究不同麥汁溶解氧含量對黑啤酒高級醇含量的影響

通過控制黑麥芽汁不同溶解氧含量（4～12 mg/L），其他發(fā)酵條件相同，檢測高級醇含量。

1.3.5 研究發(fā)酵溫度對黑啤酒高級醇含量的影響

黑啤酒發(fā)酵采用的是下面酵母發(fā)酵，發(fā)酵溫度為8～12 ℃，選擇不同溫度進(jìn)行主發(fā)酵試驗(yàn)，當(dāng)發(fā)酵度達(dá)60%時(shí)升溫至12 ℃進(jìn)行雙乙酰還原，還原結(jié)束降溫至0 ℃，發(fā)酵結(jié)束測定啤酒高級醇含量。

1.3.6 試驗(yàn)優(yōu)化

在上述單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇對黑啤酒高級醇含量影響較大的四個(gè)因素，每個(gè)因素取三個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)，并對正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母接種量對黑啤酒高級醇影響的單因素試驗(yàn)

有研究[5,12-13]表明，不同的酵母菌種對啤酒高級醇的影響有重要作用，陳長毅等[12]研究發(fā)現(xiàn)凝聚性酵母比粉末性酵母產(chǎn)高級醇少，試驗(yàn)研究采用下面發(fā)酵法生產(chǎn)洋槐蜜黑啤酒，使用的啤酒酵母為凝聚性酵母，發(fā)酵前采用不同酵母添加量，成品黑啤酒的高級醇、總酯及醇酯比見圖1。通過不同酵母添加量的研究可以看出：酵母接種量少，促進(jìn)酵母增殖，形成高級醇的數(shù)量增加；增加酵母接種量，酵母增殖減少，高級醇形成量下降，促進(jìn)總酯含量增加，有利于醇酯比下降，增加啤酒的風(fēng)味品質(zhì)。

表1 酵母接種量對黑啤酒高級醇含量的影響

2.2 發(fā)酵壓力對黑啤酒高級醇影響的單因素試驗(yàn)

目前大多數(shù)啤酒廠采用低壓帶壓發(fā)酵的方法釀造啤酒，本試驗(yàn)采用不同的主酵壓力，后酵壓力保持0.1 MPa左右，主酵壓力對黑啤酒高級醇含量的影響如表2。從表2可以看出，主酵壓力越高，高級醇含量越少，醇酯比下降。但是主酵壓力過高不利于發(fā)酵副產(chǎn)物硫化氫、乙醛等異味物質(zhì)的揮發(fā)，影響啤酒的風(fēng)味。

表2 發(fā)酵壓力對黑啤酒高級醇含量的影響

2.3 不同α-氨基氮含量對黑啤酒高級醇影響的單因素試驗(yàn)

形成高級醇的代謝途徑有降解代謝途徑和合成代謝途徑兩種，其中合成代謝途徑占75%。合成代謝途徑是由糖類提供生物合成α-氨基酸的碳骨架，在其合成的過程中形成α-酮酸，經(jīng)過脫羧和還原，形成相應(yīng)的高級醇[14]。黑啤酒中的大部分高級醇，如異戊醇、異丁醇等都是由糖代謝生成氨基酸的過程中產(chǎn)生的，麥汁中氨基酸含量會直接影響高級醇的形成。不同α-氨基氮對黑啤酒高級醇含量的影響見表3，含量高的α-氨基氮（200 mg/L）可促進(jìn)酵母增殖，通過氨基酸代謝轉(zhuǎn)換消耗α-氨基氮，中間產(chǎn)物α-酮酸的含量增加，高級醇相應(yīng)增加；如果麥汁中α-氨基氮偏低（160 mg/L），酵母可經(jīng)過糖代謝的酮酸路線形成α-酮酸，再通過聯(lián)合轉(zhuǎn)氨基作用合成氨基酸，同樣會產(chǎn)生較多的高級醇。從表3可以看出，黑啤酒的麥汁含量可控制在180 mg/L左右。

表3 不同α-氨基氮對黑啤酒高級醇含量的影響

2.4 麥汁溶解氧對黑啤酒高級醇影響的單因素試驗(yàn)

麥汁溶解氧對黑啤酒高級醇的影響見表4。從表4可以看出：當(dāng)冷麥汁充氧量由低到高從4 mg/L到12 mg/L時(shí)，高級醇含量逐漸上升，總酯含量下降，該階段冷麥汁充氧量對高級醇的形成起了重要作用，同時(shí)它明顯抑制了總酯的形成。因此，降低麥汁充氧量，酒液總酯升高，醇酯比降低。但充氧量太低不利于酵母增殖，延長發(fā)酵周期。

表4 麥汁溶氧水平對黑啤酒高級醇含量影響

2.5 發(fā)酵溫度對黑啤酒高級醇影響的單因素試驗(yàn)

發(fā)酵溫度越高，酵母增殖速度越快，高級醇的生成量也就相應(yīng)增加[15]，低溫發(fā)酵雖然可以控制高級醇的含量，但是發(fā)酵周期延長，因此，可采用低溫主發(fā)酵、高溫還原雙乙酰的方法降低高級醇的含量和促進(jìn)啤酒的成熟。發(fā)酵溫度對黑啤酒高級醇影響試驗(yàn)結(jié)果見表5。從表5可以看出，發(fā)酵溫度12 ℃，高級醇含量較高，總酯增量不大；發(fā)酵溫度8 ℃，高級醇含量較低，醇酯比也低，有利于提高黑啤酒的風(fēng)味品質(zhì)。

表5 發(fā)酵溫度對黑啤酒高級醇含量影響

2.6 綜合試驗(yàn)確定不同因素對黑啤酒高級醇含量的影響

根據(jù)影響黑啤酒高級醇含量單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇影響成品洋槐蜜黑啤酒高級醇含量變化較大的4個(gè)因素，即酵母接種量、α-氨基氮含量、麥汁溶解氧及發(fā)酵溫度。主發(fā)酵壓力采用0.02 MPa，每個(gè)因素分別取3個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)（表6），通過測定成品黑啤酒高級醇含量確定最佳工藝條件，測定結(jié)果見表7。由表7可知，最佳正交組合為A3B1C1D1，即酵母接種量1.8×107個(gè)/mL，α-氨基氮含量170 mg/L，麥汁溶解氧為6 mg/L，發(fā)酵溫度8 ℃，雙乙酰還原溫度為12 ℃。而從極差R值來看，對黑啤酒高級醇含量的影響順序是發(fā)酵溫度＞麥汁溶解氧＞酵母接種量＞α-氨基氮含量。

表6 黑啤酒高級醇含量正交試驗(yàn)因素水平

表7 黑啤酒高級醇含量正交試驗(yàn)結(jié)果分析

2.7 黑啤酒高級醇含量最佳正交組合的驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證正交試驗(yàn)的結(jié)果，按最佳正交組合A3B1C1D1進(jìn)行試驗(yàn)，平行測定3次成品黑酒高級醇的含量，取其平均值，測定結(jié)果見表8。從表中可以看出，最佳正交組合的黑啤酒高級醇含量達(dá)75.76 mg/L，相比優(yōu)化前（90.37 mg/L）下降了16.17%，醇酯比為5.58，酒體口味醇厚，焦香味濃，有效地改善了啤酒的風(fēng)味品質(zhì)。

表8 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

影響黑啤酒中高級醇形成的因素很多，其中80%高級醇是在黑啤酒主發(fā)酵期間形成的，酵母菌種質(zhì)量、接種量的多少、α-氨基氮含量、溶氧情況、啤酒發(fā)酵溫度、壓力、酵母的回收排放均能影響高級醇的形成。研究試驗(yàn)在高濃黑啤酒發(fā)酵工藝中對酵母接種量、α-氨基氮含量、溶氧情況、啤酒發(fā)酵溫度及壓力方面對高級醇的形成研究進(jìn)行優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果表明：采用0.02 MPa微壓帶壓發(fā)酵，酵母接種量1.8×107個(gè)/mL、α-氨基氮含量控制在170 mg/L，麥汁溶解氧為6 mg/L，發(fā)酵溫度8 ℃，雙乙酰還原溫度為12 ℃，14 °P黑啤酒高級醇含量達(dá)75.76 mg/L，相比優(yōu)化前（90.37 mg/L）下降了16.17%，醇酯比為5.58，改善了啤酒的風(fēng)味品質(zhì)。對黑啤酒高級醇影響因素從大到小順序依次是發(fā)酵溫度、麥汁溶解氧、酵母接種量及α-氨基氮含量。