魏陳楠，金惠玉*，陳彥鳳，趙嵐*

1. 黑龍江東方學(xué)院（哈爾濱 150066）；2. 黑龍江省疾病預(yù)防控制中心（哈爾濱 150036）

咖啡因是咖啡豆、茶葉等天然植物中常見的一種黃嘌呤類生物堿化合物，主要分布于植物的幼嫩組織部位，化學(xué)式C8H10N4O2，化學(xué)名稱1, 3, 7-三甲基黃嘌呤（137X）[1]?？Х纫蚓哂信d奮心臟、骨骼肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗氧化、舒張血管、松弛平滑肌等生理作用[2]，但大劑量或長期使用咖啡因會對人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成損害，引發(fā)心臟病和高血壓，且咖啡因具有成癮性，停用會出現(xiàn)渾身困乏疲軟、精神萎頓、頭痛、抑郁等各種戒斷癥狀，因此咖啡因又被列入國家管制的精神藥品范圍[3-5]。約80%的世界人口每天都在飲用含咖啡因的產(chǎn)品，其中最普遍的是咖啡（71%）、軟飲料（16%）和茶（12%）[6]。各國對飲料中的咖啡因都有相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。

飲料中咖啡因前處理技術(shù)有直接上機法、超聲提取、溶劑提取、氧化鎂法、超聲輔助提取等[7-11]方法，但都是針對不同種飲料，而利用Box-Behnken設(shè)計-響應(yīng)面優(yōu)化的前處理方法適用于所有飲料中的咖啡因前處理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品（純度大于99%，中國物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中心）；甲醇、乙腈（色譜純，德國Merck公司）；甲酸（色譜純，中國DiKmapure公司）；純水（德國CNW公司）；氧化鎂（天津科密歐有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（美國Waters e2695公司）；色譜柱C18（5 μm，200 mm×4.6 mm，Diamonsil）；手動單道移液槍（200 μL，1 mL和5 mL，美國RAININ公司）；漩渦振蕩器（REAX系列，德國Heidolph）；KQ-500VED型雙頻數(shù)超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；電子天平（CP324S德國Sartorius）；0.22 μ m、0.45 μm微孔濾水膜（中國Dikma公司）等。

1.3 試驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取0.9 mg（精確至0.1 mg）標(biāo)準(zhǔn)樣品于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，則配制成90 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，然后從儲備液中吸取0，25，50，100和200 μL的標(biāo)定容到1 mL的進樣小瓶中，在上高效液相色譜（流速1.0 mL/min，流動相V甲醇∶V水=30∶70）中進行測定，標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=3.15×104X-1.57×105，R2=0.999 7。

1.3.2 樣品制備

取5 mL空白樣品（即不含咖啡因的飲料）定容于5 mL容量瓶中，并稱質(zhì)量；加入300 μL的90 μg/mL咖啡因標(biāo)準(zhǔn)儲備液；將溶液用振蕩器混合均勻。得到5.4 μg/mL的樣品溶液。

1.3.3 樣品測定

將前處理之后的樣品，按1.3.1的高效液相色譜條件進行測定，得出相應(yīng)測定值。

1.3.4 樣品回收率的計算

1.3.5 樣品前處理單因素試驗

1.3.5.1 超聲溫度對飲料中咖啡因的回收率的影響

按照1.3.2制備樣品，固定超聲時間20 min，氧化鎂加入0.2 g，選擇超聲溫度20，25，30，35和40 ℃。得到樣品靜置30 min，取清液，按照試驗方法1.3.3和1.3.4對飲料中前處理的樣品進行測定和回收率計算，每組試驗平行做6次。

1.3.5.2 超聲時間對飲料中咖啡因的回收率的影響

按照1.3.2制備樣品，固定超聲溫度40 ℃，氧化鎂加入0.2 g，選擇超聲時間0，10，20，30和40 min。得到樣品靜置30 min，取清液，按照試驗方法1.3.3和1.3.4對飲料中前處理的樣品進行測定和回收率計算，每組試驗平行做6次。

1.3.5.3 氧化鎂用量對飲料中咖啡因的回收率的影響

按照1.3.2制備樣品，固定超聲溫度40 ℃、超聲時間20 min，選擇氧化鎂用量0，0.2，0.5，0.8和1.1 g。得到樣品靜置30 min，取清液，按照試驗方法1.3.3和1.3.4對飲料中前處理的樣品進行測定和回收率計算，每組試驗平行做6次。

1.3.6 樣品前處理響應(yīng)面試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，利用Design-Expert的Box-Behnken試驗設(shè)計，選擇超聲溫度（A）、超聲時間（B）、氧化鎂質(zhì)量（C）三因素三水平的響應(yīng)面試驗（每組試驗平行做6次），考察因素及因素間交互作用對飲料中咖啡因回收率的影響，試驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平表

1.3.7 樣品前處理試驗數(shù)據(jù)處理

用Expert整理數(shù)據(jù)，將單因素試驗得出的數(shù)據(jù)用Origin 85作曲線圖，用Design-Expert 8.0.6設(shè)計并分析飲料中咖啡因的最佳前處理條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 超聲溫度對飲料中咖啡因的回收率的影響

從圖1可以看出，超聲溫度在20～35 ℃時，隨著超聲溫度增加，咖啡因回收率逐漸增大，咖啡因回收率最大達94.8%。超聲溫度繼續(xù)增加，咖啡因回收率開始有下降趨勢，可能是溫度過高使得咖啡因結(jié)構(gòu)遭到破壞導(dǎo)致咖啡因回收率下降[12]。因此，超聲溫度最佳條件為35 ℃。

圖1 超聲溫度對飲料中咖啡因回收率的影響

2.1.2 超聲時間對飲料中咖啡因的回收率的影響

從圖2可以看出，超聲溫度在0～20 min時，隨著超聲時間增長，咖啡因回收率逐漸增大，咖啡因回收率最大達95.12%。超聲時間繼續(xù)增加，咖啡因回收率基本不再改變，所以超聲時間最佳條件為20 min。

圖2 超聲時間對飲料中咖啡因回收率的影響

2.1.3 氧化鎂用量對飲料中咖啡因的回收率的影響

從圖3可以看出，氧化鎂用量在0～0.2 g時，隨著氧化鎂用量增加，咖啡因回收率逐漸增大，咖啡因回收率最大達95.2%。氧化鎂用量繼續(xù)增加，咖啡因回收率開始降低，因此氧化鎂用量最佳條件為0.2 g。

圖3 氧化鎂用量對飲料中咖啡因回收率的影響

2.2 樣品前處理響應(yīng)面試驗結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，利用Design-Expert的Box-Behnken試驗設(shè)計，選擇超聲溫度（A）、超聲時間（B）、氧化鎂用量（C）三因素三水平的響應(yīng)面試驗，共17組試驗，從而得到對飲料中咖啡因前處理的最佳條件，見表2。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

2.2.1 咖啡因回收率回歸模型的建立和方差分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表3所得數(shù)據(jù)進行響應(yīng)面試驗分析，以咖啡因的回收率（Y）為響應(yīng)值，對各因素超聲溫度（A）、超聲時間（B）、氧化鎂用量（C）為變量分別進行二元多次回歸方程分析，二元多次方程為：Y=95.70+5.70A-0.92B-1.53C-1.96AB+1.36AC-1.51BC-4.50A2-4.4B2-5.09C2。由表3回歸方程的方差分析結(jié)果可知，試驗?zāi)５腇值為57.85，p＜0.000 1，該試驗?zāi)Ｐ鸵呀?jīng)達到極顯著水平，則說明該二項式方程與實際回收情況擬合關(guān)系很好，證明咖啡因的回收率與超聲溫度、超聲時間、氧化鎂質(zhì)量關(guān)系良好；該二項式方程決定系數(shù)R2=0.986 7，說明飲料中咖啡因的回收率與預(yù)測值非常接近，擬合度高和該回歸模型可靠性高，同時校正后修復(fù)系數(shù)R2adj=0.969 7，說明有96.97%的響應(yīng)值變化可以被模型接受。次變異系數(shù)C.V=1.23%，說明該回歸模型的置信度較高，試驗的可靠性和精確度較好；方程的失擬項F值為5.16，p=0.073 4＞0.05，表示該回歸模型的失擬度不顯著，表明影響飲料中咖啡因前處理時回收咖啡因的未知因素對試驗結(jié)果干擾較小，說明該回歸模型的預(yù)測值與試驗值能有較好的吻合度，所以可用模型來分析和預(yù)測飲料中咖啡因前處理之后咖啡因回收率的大小。

由表3可知p值大小，A對咖啡因回收率極具顯著性，B、C具有顯著性，A和B、A和C、B和C具有顯著性。由表3可知F值大小，3個因素對咖啡因回收率的影響顯著程度排序為A＞C＞B，并且各試驗因素交互作用對咖啡因回收率的影響強弱依次為AB＞BC＞AC。因此，該二元多次方程較好描述咖啡因回收率隨著各種因素的變化規(guī)律，具有良好的分析和預(yù)測指導(dǎo)性。

表3 咖啡因含量方差分析

2.2.2 咖啡因回收率響應(yīng)面和等高線圖分析

根據(jù)二項式數(shù)學(xué)模型，應(yīng)用Design-Expert 8.0.6軟件，繪制考察指標(biāo)與影響較顯著的兩個自變量的三維響應(yīng)面圖和二維等高線圖，可以直觀地反映各因素對效應(yīng)值的影響，每個效應(yīng)面對其中兩個因素進行分析，另外一個因素固定在零水平上。從試驗所得的三維響應(yīng)面圖上可以看出它們在反應(yīng)過程中的相互作用，如圖4所示。

由圖4三維響應(yīng)面圖及二維等高線圖可直觀觀察各因素及各因素之間關(guān)系，等高線表現(xiàn)為橢圓形或效應(yīng)面傾斜度陡峭，說明該因素對咖啡因回收率的影響越顯著，等高線越密集表明該因素對咖啡因回收率的影響效果越大；等高線表現(xiàn)為偏圓形或效應(yīng)面傾斜度平滑，則說明該因素對咖啡因回收率的影響不顯著，等高線越稀疏表明該因素對咖啡因回收率的影響效果越小。各影響因素對咖啡因回收率的影響不是簡單的線性關(guān)系，各等高線呈橢圓形或圓形，效應(yīng)面傾斜度較陡峭，表明兩試驗因素間的相互影響較為顯著。從二維等高線上看，在超聲溫度35 ℃、超聲時間20℃、氧化鎂用量0.2 g附近值時，對提高咖啡因回收率有重要影響。

結(jié)合三維響應(yīng)面圖和二維等高線圖分析可知，各試驗因素的主次順序為A＞C＞B。

2.2.3 咖啡因回收率最佳條件的選取及驗證試驗

根據(jù)回歸模型，利用Design-Expert 8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行分析，見圖5得到飲料中咖啡因前處理的最優(yōu)化條件為：超聲溫度38.43 ℃、超聲時間17.48 min、氧化鎂用量0.2 g，咖啡因回收率預(yù)測值為97.78%?？紤]到實際操作的可行性，將優(yōu)化條件修正為：超聲溫度38 ℃、超聲時間18 min、氧化鎂用量0.2 g。根據(jù)預(yù)測得出的最優(yōu)提取工藝條件，平行進行6次驗證試驗，咖啡因回收率分別為96.12%，97.03%，96.88%，96.52%，98.29%和96.90%，平均值為96.91%，即回收率為96.91%±0.75%，與預(yù)測值的相對誤差為-0.84%，表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有準(zhǔn)確的預(yù)測性，所選前處理條件具有較好重現(xiàn)性。

圖4 因素交互作用對咖啡因回收率的影響

圖5 數(shù)值優(yōu)化法試驗結(jié)果

3 結(jié)論

優(yōu)化前處理方法，基于單因素試驗，利用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken試驗設(shè)計法對飲料中咖啡因前處理因素進行設(shè)計和優(yōu)化。結(jié)果表明，A和B、A和C、B和C這3種交互作用對咖啡因的回收率均有顯著性影響。利用響應(yīng)面分析方法所建立的數(shù)學(xué)模型對前處理條件優(yōu)化的結(jié)果為：超聲溫度38 ℃、超聲時間18 min、氧化鎂用量0.2 g。在此條件下得到咖啡因回收率為96.91%±0.75%，與預(yù)測值一致，從而確定飲料中咖啡因前處理的最佳條件。該前處理方法簡便，精確度高，可預(yù)測性好，適用于各類飲料，為進一步開發(fā)飲料中咖啡因的前處理方法提供科學(xué)依據(jù)和試驗基礎(chǔ)。