鄒水洋，葉植湘，邱華賢，陳銀發(fā)

東莞理工學(xué)院，食品營養(yǎng)健康工程與智能化加工研究中心，化學(xué)工程與能源技術(shù)學(xué)院（東莞 523808）

大豆是一種重要的蛋白質(zhì)類糧食資源，其蛋白質(zhì)含量約為40%，且氨基酸模式與人體所需蛋白質(zhì)模式十分相近。大豆蛋白經(jīng)蛋白酶水解后生成大豆多肽、大豆寡肽以及游離氨基酸。大豆肽具有多種生物學(xué)活性，如抗氧化[1]、降血脂和膽固醇等[2-3]。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)大豆肽對微生物生長與代謝有促進(jìn)作用[4-6]，但這方面的研究報道還較少。

γ-聚谷氨酸（γ-polyglutamic acid，γ-PGA）是一種新型生物高分子材料，在多個工業(yè)領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊，其中通過γ-聚谷氨酸改變食品的生理特性、物理特性以及味覺的功能已得到應(yīng)用[7]。γ-聚谷氨酸一般采用微生物發(fā)酵法合成[7]，生產(chǎn)成本較高，價格較昂貴。發(fā)酵工藝的改進(jìn)是提高其生產(chǎn)水平、降低生產(chǎn)成本的重要途徑。試驗(yàn)前期對γ-聚谷氨酸的發(fā)酵工藝進(jìn)行了較多研究[8-9]，并選育出一株有較強(qiáng)合成γ-聚谷氨酸潛力的菌株[9]——枯草桿菌Dg5041，但γ-聚谷氨酸的產(chǎn)率還有待提高?；诖蠖闺脑讦?聚谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用仍鮮見報道，試驗(yàn)將大豆蛋白水解物用作培養(yǎng)枯草桿菌的氮源物質(zhì)來發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸，以期為γ-聚谷氨酸的發(fā)酵工藝提供新的基質(zhì)材料，同時拓展大豆肽的應(yīng)用領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis Dg5041，東莞理工學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保存）；大豆、豆芽（市售）；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶（酶活20～80萬 U/g，江蘇銳陽生物科技有限公司）；味精（谷氨酸鈉≥99%，廣州奧桑味精食品有限公司）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純或生化試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1 F凈化工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；LRH-150生化培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；YM-50立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海三中醫(yī)療器械有限公司）；HQL 300 B柜式恒溫冷凍搖床（武漢中科科儀技術(shù)發(fā)展公司）；TDL-5-A多管離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；DD-6水浴鍋（廣州環(huán)宇實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；DJ 12 B豆?jié){機(jī)（九陽股份有限公司）；YP 5002電子天平（常州衡正電子儀器有限公司）；PHS-3 C型pH計（上海儀電科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大豆蛋白的酶解

豆?jié){的制備：大豆清洗后以1∶10的比例加入蒸餾水，室溫浸泡8 h，用豆?jié){機(jī)打漿過濾去渣得大豆?jié){液，固形物濃度約為6%。

大豆蛋白的酶解：將100 mL大豆?jié){液裝入250 mL錐形瓶，調(diào)節(jié)pH至各蛋白酶最適pH和最適溫度并維持穩(wěn)定，加入0.8 g蛋白酶，水浴保溫攪拌120 min，加熱滅酶活，冷卻后，離心、過濾，去除沉淀物及漂浮的脂肪，所得淺黃色清液即為大豆蛋白水解物。

1.3.2 菌種培養(yǎng)與發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸

斜面培養(yǎng)基和種子液培養(yǎng)基的配制及菌種培養(yǎng)方法參見文獻(xiàn)[9]。

大豆蛋白水解物培養(yǎng)基：50 mL 3%固形物含量的大豆蛋白水解物裝入250 mL錐形瓶，加10 g/L入葡萄糖、40 g/L谷氨酸鈉，pH 7.0。以上培養(yǎng)基在110 ℃ 20 min滅菌后冷卻至室溫，備用。

γ-聚谷氨酸的發(fā)酵：按4%接種量將種子液接入大豆蛋白水解物培養(yǎng)基，在37 ℃ 150 r/min恒溫?fù)u床培養(yǎng)48 h。發(fā)酵完成后將發(fā)酵液離心分離（5 000 r/min，20 min），取上清液，測定γ-聚谷氨酸含量。枯草桿菌在普通培養(yǎng)基中的發(fā)酵方法參見文獻(xiàn)[9]優(yōu)化的結(jié)果。以上試驗(yàn)平行3次，結(jié)果取平均值。

1.4 分析測試

大豆蛋白水解度（DH）參見文獻(xiàn)[10]提供的甲醛滴定法進(jìn)行測定，DH=水解物氨態(tài)氮含量/水解物總氮含量×100%。

γ-聚谷氨酸粗品產(chǎn)量測定采用乙醇沉淀法[8]。

2 結(jié)果與討論

此次研究未采用大豆分離蛋白而采用大豆?jié){液進(jìn)行酶解試驗(yàn)，主要是基于實(shí)際生產(chǎn)的考慮。一方面大豆分離蛋白價格較昂貴，另一方面大豆?jié){液中除蛋白質(zhì)外還含有豐富的可溶性糖類、礦物質(zhì)、磷脂、維生素等營養(yǎng)成分，可作為后續(xù)微生物生長代謝的營養(yǎng)基質(zhì)利用。

2.1 pH對大豆蛋白酶解的影響

酶的活性受pH的影響較為顯著，在一定的pH范圍內(nèi)，酶才表現(xiàn)出催化活性。將堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶控制在55 ℃，中性蛋白酶、酸性蛋白酶控制在45℃條件下進(jìn)行酶解試驗(yàn)，結(jié)果如圖1所示。

從圖1可以看出，堿性蛋白酶最適pH為9.5；中性蛋白酶和木瓜蛋白酶最適pH為7.0；酸性蛋白酶最適pH為3.5，以下試驗(yàn)的pH均按此優(yōu)化結(jié)果。當(dāng)酸堿度偏離最適作用pH時，大豆蛋白DH均有明顯的下降趨勢。這由于pH過高或過低可使蛋白酶的空間結(jié)構(gòu)改變，從而蛋白酶失活，或者改變底物的解離狀態(tài)，影響底物與酶的結(jié)合。所以，在進(jìn)行大豆蛋白酶解反應(yīng)中，要嚴(yán)格控制酶解過程的pH。

2.2 溫度對大豆蛋白酶解的影響

溫度對酶作用的影響比較復(fù)雜，提高溫度會提高反應(yīng)速率，同時也可能導(dǎo)致酶的變性失活，因此在最適宜的酶解溫度下，才能達(dá)到最高的酶解的效率。

從圖2可以看出，隨著反應(yīng)溫度的增加，大豆蛋白DH先上升后下降，存在一個峰值，不同蛋白酶的DH峰值對應(yīng)的溫度有所不同，該溫度即為酶的最適作用溫度。堿性蛋白酶的最適作用溫度為60 ℃；中性蛋白酶和酸性蛋白酶的最適作用溫度為45 ℃；木瓜蛋白酶最佳的反應(yīng)溫度為55 ℃，以下試驗(yàn)均按此優(yōu)化溫度進(jìn)行。

圖1 pH對大豆蛋白酶解的影響

圖2 溫度對蛋白酶水解效果的影響

2.3 底物濃度對大豆蛋白酶解的影響

底物濃度不僅影響酶解速度，也關(guān)乎生產(chǎn)成本。通過改變打漿時料水比或稀釋度將豆?jié){固形物含量調(diào)整至2%～10%來進(jìn)行酶解試驗(yàn)，結(jié)果見圖3。大豆蛋白DH隨豆?jié){固形物濃度的升高而升高，在豆?jié){固形物濃度上升至6.0%時，大豆蛋白DH達(dá)到最高值，隨后下降。底物濃度很低時，酶與底物碰撞概率小，酶解效率低。底物濃度過高，蛋白質(zhì)分子會通過疏水和二硫健作用，形成網(wǎng)狀聚合體。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)豆?jié){固形物濃度越高，體系的流動性越差，豆?jié){中其他非蛋白成分越多，這些均不利于底物與蛋白酶的接觸，導(dǎo)致酶解效率降低。考慮到成本問題，豆?jié){固形物濃度控制在6%較合適。

2.4 酶濃度對大豆蛋白酶解的影響

當(dāng)?shù)孜餄舛冗h(yuǎn)大于酶濃度時，酶促反應(yīng)速度隨著酶濃度的增加而增加。將酶質(zhì)量濃度設(shè)置為2.0～10.0 g/L進(jìn)行酶解試驗(yàn)，酶濃度對大豆蛋白酶解的影響如圖4所示。隨著酶濃度的增大，大豆蛋白DH均逐漸升高，當(dāng)酶質(zhì)量濃度達(dá)到8.0 g/L后，酸性蛋白酶和中性蛋白酶繼續(xù)提高酶濃度對大豆蛋白DH增加量很小，而堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶繼續(xù)增加酶濃度使大豆蛋白DH還略有下降。這可能是蛋白酶濃度過高，會發(fā)生自水解反應(yīng)[11]，導(dǎo)致其活力下降。綜合酶解效率與成本考慮，上述4種蛋白酶的酶用量選8.0 g/L較為合理。

圖3 底物濃度對大豆蛋白水解的影響

圖4 酶質(zhì)量濃度對大豆蛋白水解的影響

2.5 酶解時間對大豆蛋白酶解的影響

在相同的條件下，酶解時間越長，蛋白質(zhì)酶解越充分，但相應(yīng)生產(chǎn)成本也會增加。試驗(yàn)考察了大豆蛋白水解度隨酶解時間變化的關(guān)系，結(jié)果見圖5。4種蛋白酶的大豆蛋白DH-時間關(guān)系曲線類似，隨著酶解時間的延長，酶解速率逐漸降低，符合一般酶解規(guī)律。當(dāng)酶解時間達(dá)120 min后，大豆蛋白DH增速變緩，考慮到能耗及酶解液變質(zhì)等因素，酶解時間選120 min較合適。

綜合前文試驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)：4種蛋白酶對大豆蛋白的酶解效果有較大差異，其中堿性蛋白酶效果最好，其次為中性蛋白酶，酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶效果較差。不同蛋白酶對蛋白質(zhì)水解的位點(diǎn)不同會導(dǎo)致酶水解能力的差異，酶解溫度的不同也會對水解速率產(chǎn)生影響。對于大豆蛋白，堿性蛋白酶是較合適的水解酶。

2.6 大豆蛋白水解物作氮源對發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的影響

將不同蛋白酶在優(yōu)化酶解條件下得到的大豆蛋白水解物經(jīng)適度稀釋后（固形物濃度3%）作為氮源來制備培養(yǎng)基，考察大豆蛋白水解物對枯草桿菌Dg5041合成γ-PGA的影響，結(jié)果如表1所示。

從表1結(jié)果顯示，大豆蛋白水解物能顯著促進(jìn)枯草桿菌合成γ-聚谷氨酸，其水解度越高，枯草桿菌生產(chǎn)的γ-聚谷氨酸越多。其中堿性蛋白酶酶解的大豆蛋白水解物DH（16.44%）最高，以此作為氮源發(fā)酵生產(chǎn)的γ-聚谷氨酸產(chǎn)量也最高，達(dá)到37.58 g/L。而使用其他蛋白酶酶解的大豆蛋白DH較低，發(fā)酵液中γ-聚谷氨酸含量也相應(yīng)較低。直接用大豆蛋白作氮源的培養(yǎng)基（對照1）只能產(chǎn)生少量的γ-聚谷氨酸。這說明大豆蛋白水解物對合成γ-聚谷氨酸的促進(jìn)作用是源于大豆肽而不是蛋白質(zhì)或水解物中其它成分。試驗(yàn)所用的枯草桿菌Dg5041可能酶解蛋白能力較弱，對大豆蛋白利用率低，在培養(yǎng)期內(nèi)生長較緩慢。

相比于使用酵母膏作氮源的普通培養(yǎng)基[9]（對照2），大豆蛋白水解物培養(yǎng)基能更好地促進(jìn)枯草桿菌Dg5041合成γ-聚谷氨酸，其γ-聚谷氨酸最高水平比普通培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)量提高106.8%，表現(xiàn)出顯著的優(yōu)勢。類似的例子有李玉珍等[4]的報道，以牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基作為參照，大豆蛋白復(fù)合酶解產(chǎn)物作為氮源可以提高枯草桿菌的生物量和蛋白酶產(chǎn)量。萬春艷等[6]的研究也發(fā)現(xiàn)，分子質(zhì)量不同的大豆肽，其生物學(xué)活性不同，在DH 6.37%～19.98%范圍內(nèi)，水解物的促生長活性隨著DH的增大而增加，但更高DH水解物的促生長活性反而有所降低。這啟示在大豆蛋白水解物的應(yīng)用中，必須建立適度水解的概念。大豆蛋白DH與枯草桿菌合成γ-聚谷氨酸的關(guān)聯(lián)性及其機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

圖5 酶解時間對大豆蛋白水解的影響

表1 大豆蛋白水解物對枯草桿菌合成γ-PGA的影響

3 結(jié)論

堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶在各自優(yōu)化的酶解條件下對大豆蛋白的酶解效果有較大差異，其中堿性蛋白酶效果最好，其次為中性蛋白酶，酸性蛋白酶和木瓜蛋白酶效果較差。大豆蛋白水解物能顯著促進(jìn)枯草桿菌合成γ-聚谷氨酸，在0.02%～16.44%水解度范圍內(nèi)，大豆蛋白水解度越高，枯草桿菌合成的γ-PGA產(chǎn)量越高。其中，堿性蛋白酶大豆蛋白水解物培養(yǎng)基發(fā)酵生產(chǎn)的γ-PGA粗品產(chǎn)量最高，比普通培養(yǎng)基發(fā)酵產(chǎn)量提高106.8%。作為一種廉價易得又能高效促進(jìn)微生物生長發(fā)酵的基質(zhì)材料，大豆蛋白水解物在微生物領(lǐng)域的應(yīng)用有待廣泛而深入的研究。