馮孝杰，沈倩婷，陳犇，陳俊沲，周瑾，孫小紅

紹興文理學院元培學院（紹興 312000）

香榧（Torreya grandis）屬紅豆杉科榧屬（Torreya）植物，是中國特有的珍稀堅果樹種之一，主要集中分布在長江流域以南海拔300～800 m亞熱帶山地。浙江省諸暨市香榧栽培產(chǎn)量占全國1/2以上，有“中國香榧之鄉(xiāng)”之稱[1-2]。香榧籽含油率為546.2～614.7 g/kg，脂肪酸以亞油酸和油酸為主，含有17種氨基酸，19種礦物元素，其中鉀、鈣、磷、鎂等含量高，營養(yǎng)豐富，是一種優(yōu)質(zhì)美味堅果[3-5]。香榧假種皮是包裹在香榧種子外面的一層厚的肉質(zhì)化結構，占種子鮮質(zhì)量50%～60%。香榧假種皮是香榧加工過程中下腳料，長期被丟棄，腐爛過程造成環(huán)境污染。研究發(fā)現(xiàn)香榧假種皮中含有醇、醛、酮、烯等20余種芳香成分，可作為提取高級精油的天然優(yōu)質(zhì)原料[6-8]。另據(jù)報道，香榧假種皮中富含紫杉醇和榧黃素等具有抗病毒和抗腫瘤的活性成分[9-11]。因此開發(fā)利用香榧假種皮功能成分，在醫(yī)藥、食品和日用化工等領域有廣闊市場前景[12-13]。

試驗采用纖維素酶破壞其細胞壁，使香榧假種皮中的多酚類物質(zhì)充分釋放，結合二次通用旋轉設計方法，建立以多酚提取率為目標函數(shù)的數(shù)學模型，重點考察提取溫度、pH、料液比和加酶量對多酚得率的影響，為香榧假種皮的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香榧假種皮（采自浙江省諸暨市）；沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定所）；纖維素酶（安徽酷兒生物工程有限公司）；其他所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

722 N可見分光光度計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；SK 2200 H超聲儀（上海科導超聲儀器有限公司）；H 1850離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

香榧假種皮經(jīng)粉碎機粉碎后、過篩、烘干、密封備用。

1.3.2 多酚含量測定

多酚含量測定參照文獻采用Folin-Ciocalteu（FC）法[14-15]，采用沒食子酸為標準品，制備質(zhì)量濃度1 mg/mL沒食子酸對照品溶液。分別取1，2，3，4和5 mL標準品溶液定容至100 mL。分別取上述溶液1 mL，加入1 mL福林酚試劑，加入8 mL 7.5 g/100 mL碳酸鈉溶液混勻，40 ℃水浴保持20 min，波長765 nm，測定吸光度并繪制標準曲線，以沒食子酸標準溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X）、吸光度為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得到標準曲線方程Y=0.005 1X+0.004 4，R2=0.997 7。

1.3.3 纖維素酶酶活的測定

1.3.3.1 纖維素酶活測定原理

纖維素酶能夠水解羧甲基纖維素（CMC）分子中的β-1, 4葡萄糖苷鍵，將還原糖釋放出來（以葡萄糖計），與3, 5-二硝基水楊酸（DNS）反應產(chǎn)生顏色變化，顏色的變化程度與釋放還原糖的量呈正比，在550 nm測得的吸光度對照標準曲線（以葡萄糖為標準物）確定釋放還原糖的量，從而計算出纖維素酶活力[16-17]。

1.3.3.2 纖維素酶活力單位定義

1 g酶粉（1 mL酶液）于50 ℃、pH 5.5條件下，1個纖維素酶活力單位定義為每分鐘水解1% CMC溶液產(chǎn)生1 μmol還原糖的酶量，計算如式（1）。

纖維素酶活力（U/mL）=A×D/（t×V） （1）式中：A為標準曲線上對應葡萄糖量，mg/mL；D為酶液稀釋倍數(shù)；t為反應時間，min；V為測定用酶液體積，mL。

1.3.4 單因素試驗

考察不同提取方式、溫度、時間、pH、加酶量及料液比對多酚提取率的影響，從而確定適宜的提取條件。

1.3.4.1 不同提取方法的考察

選擇以50%乙醇為提取溶劑，在浸提溫度50 ℃，料液比1∶10 g/mL，浸提時間30 min條件下，分別考察超聲波輔助浸提，酶法浸提（pH 5.5，加酶量0.2 mL）及超聲波輔助酶法浸提等提取方式，測定吸光度，確定最佳提取方式。

1.3.4.2 提取溫度的選擇

準確稱取2 g香榧假種皮粉末，置于提取容器中，在浸提時間30 min，pH 5.5，料液比1∶10 g/mL，加酶量0.2 mL基礎上，分別用超聲提取，考察提取溫度在40，50，60和70 ℃對提取率的影響，將粗提液經(jīng)3 500 r/min離心機離心過濾后定容，測定總酚含量，確定最佳提取溫度。

1.3.4.3 提取時間的選擇

準確稱取2 g香榧假種皮粉末，置于提取容器中，在浸提溫度60 ℃，pH 5.5，料液比1∶10 g/mL，加酶量0.2 mL基礎上，分別用超聲提取，考察提取時間為30，45，60和75 min時對提取率的影響，將粗提液經(jīng)3 500 r/min離心機離心過濾后定容，測定總酚含量，確定最佳提取時間。

1.3.4.4 提取pH的選擇

準確稱取2 g香榧假種皮粉末，置于提取容器中，在浸提溫度60 ℃，浸提時間60 min，料液比1∶10 g/mL，加酶量0.2 mL基礎上，分別用超聲提取，考察浸提pH為5.0，5.5，6.0和6.5時對提取率的影響，將粗提液經(jīng)3 500 r/min離心機離心過濾后定容，測定總酚含量，確定最佳提取pH。

1.3.4.5 提取料液比的選擇

準確稱取2 g香榧假種皮粉末，置于提取容器中，在浸提溫度60 ℃，浸提時間60 min，pH 6，加酶量0.2 mL基礎上，分別用超聲提取，考察料液比為1∶10，1∶12和1∶14 g/mL時對提取率的影響，將粗提液經(jīng)3 500 r/min離心機離心過濾后定容，測定總酚含量，確定最佳料液比。

1.3.4.6 提取加酶量的選擇

準確稱取2 g香榧假種皮粉末，置于提取容器中，在浸提溫度60 ℃，浸提時間60 min，pH 6，料液比1∶14 g/mL基礎上，分別用超聲提取，考察加酶量為0.2，0.4和0.6 mL時對提取率的影響，將粗提液經(jīng)3 500 r/min離心機離心過濾后定容，測定總酚含量，確定最佳提取溫度。

1.3.5 樣品中總酚得率的測定

取10 mL提取液于離心管中，放入離心機，離心10 min（3 500 r/min）后，精密量取0.2 mL上清液于試管中，用蒸餾水稀釋至10 mL，同標準曲線制作相同方法取1 mL稀釋樣品依次加入1 mL福林酚試劑，8 mL 7.5 g/100 mL的碳酸鈉溶液混勻，40 ℃水浴保持20 min，在765 nm處分別測定吸光度，求得樣品中總酚含量?？偡拥寐视嬎闳缡剑?）。

1.3.6 浸提條件的探討

在單因素試驗所確定的適宜條件范圍內(nèi)，采用二次通用旋轉設計，以總酚得率為響應值，通過考察各因素對總酚得率的協(xié)同影響，確定最優(yōu)浸提條件，該設計采用SAS數(shù)據(jù)處理中響應面進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 不同提取方式對香榧假種皮總酚得率的影響

不同提取方式對香榧假種皮總酚得率的影響試驗結果見圖1。不同提取方式總酚溶出量不同，提取率從小到大依次是超聲波浸提、酶法浸提、超聲波輔助酶法浸提，且在超聲波輔助酶法浸提條件下總酚得率最大，故試驗選取超聲波輔助酶法浸提。

圖1 不同提取方式對總酚得率的影響

2.1.2 提取溫度的選擇

不同提取方法試驗結果見圖2。在一定范圍內(nèi)，總酚得率隨著溫度增加而升高，且在60 ℃時達到最大值，超過60 ℃后由于纖維素酶活性受到抑制，總酚得率出現(xiàn)下降趨勢，故選取提取溫度60 ℃進行試驗。

圖2 提取溫度對總酚得率的影響

2.1.3 提取時間的選擇

不同提取時間試驗結果見圖3。試驗數(shù)據(jù)顯示，最初隨著提取時間增加總酚得率有較大幅度增加，但隨著時間進一步延長，其增幅慢慢下降，考慮到成本和耗時的綜合因素，故選取提取時間60 min進行試驗。

圖3 浸提時間對總酚得率的影響

2.1.4 提取pH選擇

不同pH選擇試驗結果見圖4。試驗數(shù)據(jù)顯示，不同pH條件下，總酚得率有個別差異，但總體顯示在pH 6左右時總酚得率最高，在大于或小于pH 6情況下總酚得率較低，故選擇提取pH 6進行試驗。

2.1.5 提取料液比的選擇

不同料液比試驗結果見圖5。試驗數(shù)據(jù)顯示，最初隨著料液比增加總酚得率有較大幅度增加，但隨著料液比進一步增大，其增幅慢慢下降，考慮到成本和效率綜合因素，故選取提取料液比1∶14 g/mL進行試驗。

圖4 不同pH對總酚得率的影響

圖5 浸提料液比對總酚得率的影響

2.1.6 提取加酶量的選擇

加酶量試驗結果見圖6。試驗數(shù)據(jù)顯示，起初隨著加酶量增加總酚得率有較大幅度增加，但隨著加酶量進一步增大，其總酚得率增幅漸漸平緩甚至不增長，故認為加酶量飽和，考慮到成本和效率綜合因素，故選取提取加酶量0.4 mL進行試驗。

圖6 不同提取加酶量對總酚得率的影響

2.2 纖維素酶活力測定結果

實測得纖維素酶活力為427 U/mL，稀釋10倍用于加樣。

2.3 響應模型的建立與分析

2.3.1 試驗設計

依據(jù)單因素試驗結果，綜合考慮各因素對香榧假種皮多酚提取率的影響，采用二次通用旋轉組合設計法，以香榧假種皮總酚得率為響應值，由于加酶量、浸提時間在繼續(xù)增加時交互作用不明顯，故對溫度、pH、料液比這3個因素優(yōu)化設計，試驗安排如表1所示。

表1 二次通用旋轉組合試驗因素水平表

2.3.2 響應曲面法試驗

在單因素試驗基礎上，在提取溶劑50%乙醇條件下，選取對提取物得率影響較為顯著的提取溫度（A）、pH（B）、提取料液比（C）作為變量，以香榧假種皮總酚得率（Y）為指標，利用Design-Expert軟件進行試驗設計與優(yōu)化，進行三因素三水平試驗設計[18-20]。響應面試驗設計方案及結果如表2所示。對試驗數(shù)據(jù)進行回歸分析，各項回歸系數(shù)及顯著性檢驗見表3。

香榧假種皮提取物得率與各變量之間的二次方程模型為Y=6.066 25+0.617 63A-4.385 00B+0.876 25C+0.034 500AB-0.010 800AC+0.113 00BC-0.005 225A2+0.120 00B2-0.028 300C2；響應數(shù)據(jù)的方差分析結果顯示模型的F=23.32＞F0.05(9,4)=5.999，p=0.000 2＜0.01，表明回歸模型顯著，故可用回歸方程描述各因子與響應值之間關系。由表3可知方程A、B、C影響極顯著，二次項極顯著（p＜0.001），說明響應面分析所選的主效應都達到顯著水平。其中，因素之間的交互作用也較大（p＜0.05），二次項A2、C2對提取的曲面效應影響極顯著，交互項AC、BC交互作用極顯著，AB之間交互作用達到顯著水平，表明各因素對香榧假種皮提取物得率的影響并不是簡單的線性關系。模型中對香榧假種皮提取物得率影響大小順序依次為B＞A＞C，即pH＞提取溫度＞提取料液比。

表2 響應面試驗設計及結果

表3 回歸方程方差分析

2.4 模型各因素響應曲面及等高線圖

響應面及等高線圖能夠直觀地反映出各個因素及其交互作用，利用Design-Expert 8.0.5b軟件作出兩因素交互作用的響應面及等高線圖，結果見圖7～圖9。

由圖7可以看出，在相同料液比下，提取溫度和pH對多酚提取率的交互作用。提取pH一定時，隨著提取溫度增大，多酚提取率呈先上升再下降趨勢。溫度一定時，多酚提取率隨pH升高而增大，而且響應面顯示坡度較陡，表明提取溫度和超聲功率交互作用極顯著。

圖7 溫度和pH對總酚得率交互影響的響應面圖和等高線圖

由圖8可以看出，在相同提取溫度下，料液比和pH對多酚提取率的交互作用。提取pH一定時，隨著浸提料液比增大，多酚提取率呈先上升再下降趨勢。料液比一定時，多酚提取率隨pH升高而增大，而且響應面顯示坡度較陡，表明提取溫度和超聲功率交互作用極顯著。

圖8 料液比和pH對提取物得率交互影響的響應面圖和等高線圖

圖9 料液比和提取溫度對提取物得率交互影響的響應面圖和等高線圖

由圖9可以看出，在相同提取pH下，料液比和提取溫度對多酚提取率的交互作用。提取溫度一定時，隨著料液比增大，多酚提取率呈先上升再下降趨勢。料液比一定時，多酚提取率隨提取溫度升高而增大，響應面顯示坡度較陡，且超過一定溫度呈下降趨勢，表明提取溫度和超聲功率交互作用極顯著。

2.5 最優(yōu)條件的確定與驗證

對所得模型回歸方程取一階偏導數(shù)等于零，整理可得到式（4）～（6）。

聯(lián)立解得A=59.45 ℃、pH 6.45、C=1∶17.31。因此根據(jù)響應面分析結果預測香榧假種皮提取物提取最優(yōu)工藝條件為：提取溫度59.45 ℃，pH 6.45，料液比1∶17.31 g/mL。在此工藝條件下預測多酚得率為22.45 mg/g。為檢測響應曲面法所得結果的可靠性，采用優(yōu)化條件進行重復試驗，在優(yōu)化條件下實際提取率為20.73%。與預測值相比，其相對偏差約1.79%，說明可以利用回歸方程對實際浸提進行預測和控制。因此，基于響應曲面法所得的優(yōu)化工藝參數(shù)準確可靠，具有實際價值。

3 結論

香榧假種皮多酚提取物的最優(yōu)提取工藝在單因素試驗基礎上，選取對提取物得率影響顯著的提取溫度、提取pH、料液比作為Box-Behnken試驗設計變量，以香榧假種皮多酚提取得率為響應值，對香榧假種皮提取物的提取工藝進行優(yōu)化，得出最優(yōu)工藝為：提取溶劑采用50%乙醇、酶0.4 mL（42.7 U/mL）、提取溫度59.45 ℃、pH 6.45、料液比1∶17.31 g/mL。在此條件下提取物多酚得率為22.45 mg/g。