許凌巧，王安琪，何正有，蔣用，李佳，畢建軍

成都大學(xué)四川抗菌素工業(yè)研究所（成都 610052）

人參莖葉皂苷是從人參（Panax ginsengC. A.Meyer）莖葉中提取出的一種富含人參皂苷類成分的提取物原料，廣泛應(yīng)用于藥品、保健食品等領(lǐng)域。人參皂苷口服經(jīng)消化系統(tǒng)水解后生成稀有皂苷和苷元才能被機體吸收利用，并發(fā)揮其藥理活性[4]。人參皂苷Rg3、Rh2和Compound K是最具代表性的稀有人參皂苷，具有突出的抗衰老、抗腫瘤、抗自由基、保護神經(jīng)和保護心血管等生物活性[1-3]。這3種人參皂苷單體已開發(fā)成自主知識產(chǎn)權(quán)的創(chuàng)新藥物，表現(xiàn)出良好的臨床應(yīng)用價值。但由于稀有人參皂苷在自然界含量極低且化學(xué)合成難度高，使其在藥物開發(fā)方面受到了限制。目前，人參皂苷Rg3、Rh2和Compound K主要由人參藥材中的人參二醇型皂苷經(jīng)水解制備而得[5-7]。但人參藥材存在著生長時間長、售價高等缺點，制備底物成本過高，在一定程度上限制了稀有人參皂苷的產(chǎn)量和應(yīng)用，故急需尋找一種低成本的原料用于制備稀有人參皂苷。人參莖葉皂苷原料相對易得、成本低廉，但其中稀有皂苷含量極低，采用制備稀有人參皂苷最為常用的微生物轉(zhuǎn)化和酸水解方法[9-12]，通過研究其微生物和酸降解產(chǎn)物中稀有人參皂苷的含量，以期提高其中稀有人參皂苷的含量，不僅可以直接提高人參莖葉皂苷的藥用價值，且此水解產(chǎn)物作為制備稀有皂苷的原料，可增加人參莖葉皂苷的附加值，為人參莖葉皂苷的二次開發(fā)和降低稀有人參皂苷制備成本提供了一種新的研究思路與開發(fā)方向。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人參莖葉皂苷提取物（中國·撫松縣大自然生物工程有限公司，含人參皂苷＞80%），對照品人參皂苷Rg3、Rh2和Compound K（純度：≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司），菌株Monascus purpureus Went（微生物菌種保藏中心），冰乙酸（成都市科隆化學(xué)品有限公司）、正丁醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司），甲醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司）等。

1.2 儀器與設(shè)備

立式壓力蒸汽滅菌器（LDZM-80KCS-Ⅲ，上海申安醫(yī)療器械廠）、凈化工作臺（W-CI-1F，蘇州凈化設(shè)備廠）、Agilent 1260 Series高效液相色譜儀（包括G1312A Bin Pump，G1329A ALS，G1316A TCC，G1314B VWD）、分析天平（AE 240，瑞士METTLER公司）。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 斜面培養(yǎng)基

100 mL培養(yǎng)液中含馬鈴薯20 g、葡萄糖2 g、硫酸鎂0.15 g、磷酸二氫鉀0.3 g、VB10.4片，瓊脂粉1.5 g。

1.3.2 搖瓶種子培養(yǎng)基

100 mL培養(yǎng)液中含馬鈴薯20 g、葡萄糖2 g、硫酸鎂0.15 g、磷酸二氫鉀0.3 g、VB10.4片。

1.3.3 轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基

50 mL培養(yǎng)液中含馬鈴薯10 g、硫酸鎂0.075 g、磷酸二氫鉀0.15 g、VB10.2片、積雪草提取物添加量分別為0.2，0.4，0.6和0.8 g。

1.4 試驗方法

1.4.1 對照品的制備

分別精密稱取人參皂苷Rg3、Rh2和Compound K對照品5 mg定容至10 mL，各取0.5 mL混勻制成混合對照品溶液，過濾即得。

1.4.2 色譜條件

Agilent 1260 Series高效液相色譜儀，DiamonsilTMC185 μ m，4.6 mm×250 mm色譜柱，柱溫30 ℃，流動相為甲醇：0.1%磷酸溶液（60∶40），流速1.0 mL/min，進樣量10 μL。

1.4.3 制備方法考察

1.4.3.1 微生物轉(zhuǎn)化

在超凈工作臺上，分別將菌種接于相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上，在適宜溫度下培養(yǎng)，直至長勢良好。再將培養(yǎng)好的斜面的菌株轉(zhuǎn)接于對應(yīng)的搖瓶種子培養(yǎng)液中，放入恒溫培養(yǎng)振蕩器中，在一定的溫度和轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)，直至各菌種長勢良好。最后，以16%的接種量接種于轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中，同時設(shè)有不接菌的空白對照組，均于28 ℃、以220 r/min培養(yǎng)數(shù)天。

1.4.3.2 酸水解

精確稱取0.4 g人參總皂苷提取物，分別加入食用米醋、1%醋酸80 mL，在121 ℃反應(yīng)30 min。將水解液pH調(diào)至7左右，加入正丁醇萃取，取正丁醇層揮干溶劑。精確稱取0.4 g人參總皂苷提取物，加入0.5%硫酸乙醇溶液80 mL，85 ℃下回流1 h。將水解液pH調(diào)至7左右，加入正丁醇萃取，取正丁醇層揮干溶劑。將殘渣用甲醇定容50 mL。進行HPLC檢測分析，以人參皂苷Rg3、Rh2和Compound K含量作為衡量標準。

1.4.4 單因素試驗

1.4.4.1 酸濃度考察

分別加入濃度為0.2%，0.4%，0.6%，0.8%和1%醋酸80 mL，在121 ℃反應(yīng)30 min。將水解液pH調(diào)至7左右，加入正丁醇萃取，取正丁醇層揮干溶劑。將殘渣用甲醇定容50 mL。進行HPLC檢測分析，以人參皂苷Rg3、Rh2和Compound K含量作為衡量標準。

1.4.4.2 溫度考察

分別在105，110，115，120，125和130 ℃下進行酸水解，反應(yīng)30 min。將水解液pH調(diào)至7左右，加入正丁醇萃取，取正丁醇層揮干溶劑。將殘渣用甲醇定容50 mL。進行HPLC檢測分析，以人參皂苷Rg3、Rh2和Compound K含量作為衡量標準。

1.4.4.3 底物濃度考察

分別稱取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7和0.8 g人參莖葉皂苷進行酸水解，反應(yīng)30 min。將水解液pH調(diào)至7左右，加入正丁醇萃取，取正丁醇層揮干溶劑。將殘渣用甲醇定容50 mL。進行HPLC檢測分析，以人參皂苷Rg3、Rh2和Compound K含量作為衡量標準。

1.4.5 正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，為了獲得水解的最佳工藝條件，采用正交設(shè)計法，選用混合正交表L9(34)進行表頭設(shè)計，共設(shè)3個因素，分別為酸濃度、溫度和底物濃度。按各試驗號依次完成試驗。最終以3種稀有人參皂苷總含量為指標，篩選得到最優(yōu)工藝。

1.4.6 驗證試驗

按照正交試驗結(jié)果中的最佳工藝組合將人參莖葉皂苷進行水解。重復(fù)3次。測定所得水解產(chǎn)物中稀有人參皂苷的含量，驗證工藝是否穩(wěn)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 制備方法的確定

微生物轉(zhuǎn)化與酸水解結(jié)果的對比結(jié)果如表1，由表中數(shù)據(jù)可知，以稀有人參皂苷總量為指標，轉(zhuǎn)化效果：1%醋酸＞米醋＞微生物轉(zhuǎn)化＞0.5%硫酸。微生物轉(zhuǎn)化效果不如低濃度醋酸的效果，且酸水解更為簡便省時。對比食用米醋、低濃度醋酸和硫酸3種有機酸的水解效果，結(jié)果表明：低濃度醋酸的轉(zhuǎn)化效果最優(yōu)，低濃度的硫酸得到的大部分是苷元，無法得到低取代的稀有人參皂苷。

表1 制備方法的篩選

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 酸濃度對水解結(jié)果的影響

從圖1中可知，隨著醋酸濃度的增加，稀有人參皂苷含量先增后減，醋酸濃度為0.6%時，3種人參皂苷的轉(zhuǎn)化量都達到最高值，且3種人參皂苷的變化趨勢都基本相同，故選定0.4%，0.6%和0.8%為正交試驗醋酸濃度的3個水平。

圖1 酸濃度對水解結(jié)果的影響

2.2.2 溫度對水解結(jié)果的影響

從圖2中可知：隨著溫度的增加，稀有人參皂苷含量先增后減，溫度為115 ℃時，3種人參皂苷的轉(zhuǎn)化量都達到最高值，且3種人參皂苷的變化趨勢都基本相同，另外，溫度過高會使試驗操作存在安全問題且影響人參皂苷的穩(wěn)定性。故選定110，115和120 ℃為正交試驗溫度的3個水平。

圖2 溫度對水解結(jié)果的影響

2.2.3 底物加入量對水解結(jié)果的影響

從圖3中可知，隨著底物加入量的增加，稀有人參皂苷含量先增后減，底物加入量為0.4 g時，3種人參皂苷的轉(zhuǎn)化量都達到最高值，且3種人參皂苷的變化趨勢都基本相同，故選定0.3，0.4和0.5 g為正交試驗底物加入量的3個水平。

圖3 底物加入量對水解結(jié)果的影響

2.3 正交優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選取影響提取率因素中有意義的水平做正交試驗對結(jié)果進行方差分析，計算各因素平均值和極差，以確定最佳的提取條件（見表2～表4）。

方差分析結(jié)果表明：溫度和底物加入量對轉(zhuǎn)化效果均有顯著影響（表4）。同因素中不同水平的結(jié)果均值反映了不同水平在此因素中對結(jié)果的影響，極差的大小反映了此因素的變化對結(jié)果影響的大?。ū?）。從極差分析結(jié)果來看，3個因素對轉(zhuǎn)化率的影響程度為：溫度＞底物加入量＞酸濃度。溫度的極差值最大，表明溫度是影響轉(zhuǎn)化率最為重要的因素。

表2 正交試驗水平表

表3 正交試驗結(jié)果分析

表4 方差分析結(jié)果

綜上，最優(yōu)組合為A3B1C3，即：醋酸濃度為0.8%，溫度為110 ℃，底物加入量為0.5 g。此條件下轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中稀有皂苷含量達最高值。

2.4 驗證試驗

按照正交試驗所得最優(yōu)組合A3B1C3，即：醋酸濃度為0.8%，溫度為110 ℃，底物加入量為0.5 g，進行驗證試驗并重復(fù)3次，試驗結(jié)果見表5。結(jié)果表明此工藝穩(wěn)定。

表5 驗證試驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

試驗通過單因素試驗及正交試驗優(yōu)化建立了一種提高人參莖葉皂苷中稀有人參皂苷Rg3、Rh2和Compound K含量的方法，探究了底物濃度、酸濃度、溫度3個因素對稀有皂苷轉(zhuǎn)化的影響，得到最佳條件為：底物加入量為0.5 g、酸濃度0.8%、溫度110 ℃。此時，稀有皂苷Rg3的含量從1.8%提高到8.82%、Rh2的含量從0.2%提高到1%和Compound K的含量從0.4%提高到6.09%。

人參皂苷在人參根、須、葉等各個部位均有分布，其中人參葉中含量為7.6%～12.6%，其含量高于根部3倍[4]，人參莖葉廉價易得且總皂苷含量較高，適用于作為制備稀有人參皂苷的原料。此方法使用的醋酸濃度低、無毒性，后期無需考慮去除的問題，簡單、快捷且易于工業(yè)化推廣，既充分利用了人參資源，提高人參莖葉皂苷附加值，又為稀有人參皂苷的獲得、開發(fā)與利用提供參考。