岳曉禹，陳貴敏

河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院食品與生物工程學(xué)院（鄭州 450046）

在科學(xué)技術(shù)進(jìn)步、能源發(fā)展、綠色環(huán)保等影響下，綠色健康、動物副產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)取得發(fā)展，并不斷擴(kuò)大，畜產(chǎn)品加工成為農(nóng)村小康生活進(jìn)步、國家經(jīng)濟(jì)發(fā)展、實現(xiàn)綠色環(huán)境和綠色食品開發(fā)的途徑。利用高新技術(shù)，特別是生物分離、酶工程、發(fā)酵、高壓、高真空處理技術(shù)的進(jìn)步，促進(jìn)畜產(chǎn)品生產(chǎn)和市場的需求[1]。胰腺作為畜牧業(yè)的副產(chǎn)品，具有很高的利用價值。胰腺中可以分泌胰島素平衡體內(nèi)血糖量和蛋白酶、淀粉酶等分解碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂肪的酶。淀粉酶作為一種大型工業(yè)原料，主要應(yīng)用的是水解產(chǎn)物葡萄糖、麥芽糖、低聚糖糖漿等，這些水解后的糖漿將被用于酒精發(fā)酵、醬油制作等，或直接作為產(chǎn)品用于其他領(lǐng)域（面包保鮮、醫(yī)療、洗滌劑）[2]。基于中國淀粉行業(yè)的發(fā)展需求，淀粉酶是中國需求量最大的酶。α-淀粉酶分布在自然界各種動物、植物、微生物體內(nèi)中[3]。微生物與動植物比較，微生物繁殖速度快，外界影響易去除，而動植物則不同，受大自然的影響，繁殖速度慢，外界影響大，所以應(yīng)市場需求量大部分淀粉酶是從微生物中提取。隨著科技進(jìn)步，細(xì)胞重組、DNA重組等技術(shù)促進(jìn)動植物繁殖的速度，動植物提取淀粉酶成為越來越常使用的原料。

文獻(xiàn)報道的提取胰淀粉酶的方法主要是機(jī)溶劑和鹽析法結(jié)合的方法，如異丙醇沉淀和不同濃度銨鹽溶液鹽析結(jié)合的方法[4]、不同濃度硫酸銨鹽析和凝膠層析法[5]。隨著科技進(jìn)步，環(huán)境惡化，有機(jī)溶劑和鹽析法帶來的危害受到重視。有文獻(xiàn)報道使用低濃度的有機(jī)溶劑（35%～38%稀乙醇[6]）和鹽溶液（磷酸鹽緩沖液[7]）提取工藝。胰酶提取主要還是使用有機(jī)溶劑（乙醇、丙酮）和鹽析法提??；有機(jī)溶劑不僅危險而且污染環(huán)境、成本高，鹽析法除鹽困難、對產(chǎn)品質(zhì)量有影響等弊端[8]。所以，需要研究開發(fā)一種綠色環(huán)保、高質(zhì)量、高品質(zhì)的提取α-淀粉酶工藝[9]。如何提取高活力的α-淀粉酶具有重要的實際意義。中國生豬加工行業(yè)發(fā)展巨大，能提供大量原料。

試驗以豬胰臟為原料，減少或盡量不用有機(jī)溶劑做提取劑，從胰臟中提取α-淀粉酶，使用透析袋對α-淀粉酶進(jìn)行反滲透濃縮，向提取的液體酶中加入穩(wěn)定劑配方，使液體酶在高溫下仍能保持α-淀粉酶的酶活力。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試劑

豬胰臟（鄭州雙匯集團(tuán)）；氫氧化鈉（天津市永大化學(xué)試劑有限公司）；氯化鈣（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；馬鈴薯淀粉（菱湖）、碘（天津永大化學(xué)試劑有限公司）；碘化鉀（天津永大化學(xué)試劑有限公司）；硫代硫酸鈉（鄭州派尼化學(xué)試劑廠）；鹽酸（煙臺市雙雙化工有限公司）；硫酸（煙臺市雙雙化工有限公司）；碳酸鈣（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）等。

1.1.2 設(shè)備與儀器

磁力攪拌器、離心機(jī)、恒溫水浴鍋HH-S（江蘇醫(yī)療儀器廠）；干燥箱；絞肉機(jī)（PY-790，中山市鵬宇電器有限公司）；酸度計（上海儀邁儀器科技有限公司）；全溫培養(yǎng)搖床（QYC-2102，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；移液槍（規(guī)格100～1 000 μL）；細(xì)菌培養(yǎng)箱（SPX-250L-B-1，上海福馬實驗設(shè)備有限公司）；透析袋（20000，美國）等。

1.2 工藝流程與部分操作要點

胰臟（凍藏）→預(yù)處理→提取→過濾→胰乳濾液→粗酶→濃縮→保存

1) 預(yù)處理

將新鮮豬胰或冷凍豬胰臟除去大塊脂肪，用絞肉機(jī)制成胰漿。

2) 提取

取10 g胰漿，加入20 mL（按1∶2比例）不同試劑，磁力攪拌1 h，2層紗布過濾，得到濾液，濾渣再次提取，2次濾液合并。

3) 濃縮

酶的純度越高酶活越高，采用透析濃縮的方法，對胰淀粉酶進(jìn)行濃縮提純，并研究濃縮對胰淀粉酶活力的影響，確定最佳濃縮倍數(shù)。

4) 保存穩(wěn)定性的研究

采用向胰淀粉酶中加入穩(wěn)定劑、改變溫度或pH等因素對胰淀粉酶的穩(wěn)定性影響，找出可以長期穩(wěn)定性保存的方法。

1.3 胰淀粉酶提取過程試驗設(shè)計

1.3.1 單因素試驗設(shè)計

1) 提取劑對胰淀粉酶酶活力的影響

準(zhǔn)確稱取10 g豬胰漿4份，置于干凈已標(biāo)記好的燒杯中，分別加入提取劑為：磷酸鹽緩沖液、氯化鈉溶液、水、澄清石灰水，攪拌均勻，調(diào)節(jié)各個提取劑pH 6.8、溫度25 ℃、磁力攪拌器攪拌1 h，2層紗布過濾，得胰乳，2次提取，2次提取液合并。測定胰淀粉酶活力，試驗重復(fù)至少3次，確定最佳提取劑。

2) 提取pH胰淀粉酶酶活力的影響

準(zhǔn)確稱取10 g豬胰漿6份，置于干凈已標(biāo)記好的燒杯中，分別加入提取劑澄清石灰水，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH分別為6.5，6.6，6.7，6.8，6.9和7.0，常溫下，磁力攪拌器攪拌1 h，2層紗布過濾，得胰乳，2次提取，2次提取液合并。測定胰淀粉酶活力，試驗重復(fù)至少3次，確定最佳提取pH。

3) 提取時間胰淀粉酶酶活力的影響

準(zhǔn)確稱取10 g豬胰漿4份，置于干凈已標(biāo)記好的燒杯中，分別加入提取劑澄清石灰水，攪拌均勻，調(diào)節(jié)最佳pH 6.8，常溫下，磁力攪拌器攪拌時間分別為1，2，4和6，2層紗布過濾，得胰乳，2次提取，2次提取液合并。測定胰淀粉酶活力，試驗重復(fù)至少3次，確定最佳提取時間。

4) 提取溫度胰淀粉酶酶活力的影響

準(zhǔn)確稱取10 g豬胰漿7份，置于干凈已標(biāo)記好的燒杯中，分別加入提取劑澄清石灰水，攪拌均勻，調(diào)節(jié)最佳pH 6.8，調(diào)節(jié)溫度4，15，25，30，35，40和45 ℃，最佳磁力攪拌器攪拌2 h，2層紗布過濾，得胰乳，2次提取，2次提取液合并。測定胰淀粉酶活力，試驗重復(fù)至少3次，確定最佳提取溫度。

1.3.2 正交試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗設(shè)計結(jié)果，選擇提取pH、提取時間、提取溫度、提取劑4個因素。每個因素選擇3個水平。設(shè)計正交試驗，采用L9(34)正交試驗設(shè)計，確定最佳提取工藝。正交試驗設(shè)計水平表如表1。

表1 豬胰淀粉酶提取單因素正交試驗水平表

1.4 胰淀粉酶活力測定

《中國藥典》2015版，胰淀粉酶活力測定。

1.5 試驗數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)處理方法采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析和多重比較的方法，判斷是否顯著的方法，用字母表示法表示，在表格中，在0.01水平上數(shù)據(jù)上肩注A、B、C等表示，0.05水平上數(shù)據(jù)上肩注a、b、c表示。只要同一列平均數(shù)間有一個相同字母的即為差異不顯著；凡是無相同字母的則為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 提取劑對胰淀粉酶酶活力的影響

有機(jī)溶劑污染環(huán)境、鹽析影響酶的質(zhì)量[8]。所以提取劑采用磷酸鹽緩沖液[7]、氯化鈉[10]、水[11]、澄清石灰水[12]為提取劑，減少有機(jī)溶劑的使用和鹽含量。表2可知，提取劑為磷酸鹽緩沖液、氯化鈉、水時，胰淀粉酶酶活力沒有明顯差異（p＞0.05），提取劑為水、澄清石灰水時，胰淀粉酶酶活力明顯增加（p＜0.05）。澄清石灰為提取劑時，胰淀粉酶活力最高。所以，最佳提取劑為澄清石灰水。

表2 提取劑對胰淀粉酶酶活力的影響

2.1.2 提取pH對胰淀粉酶酶活力的影響

胰淀粉酶的最適pH范圍為6.5～7.0，最適pH 6.9[4]。但豬胰臟本身都存在pH，所以探究不同pH提取對有胰淀粉酶活力的影響。有表3可知，pH 6.5～6.8時，胰淀粉酶活力增高極顯著（p＜0.05）。pH 6.8～6.9時，胰淀粉酶活力明顯下降（p＜0.05）。pH 6.9～7.0時，胰淀粉酶活力沒有明顯變化（p＞0.05）。因為pH 6.8時，酶活力值最高。所以，最適pH 6.8。

表3 提取pH對胰淀粉酶酶活力的影響

2.1.3 提取時間對胰淀粉酶酶活力的影響

由表4可知，提取時間1～2 h時，胰淀粉酶活力急劇升高（p＜0.05），提取時間2～6 h時，胰淀粉酶活力急劇下降（p＜0.05）。說明提取時間對胰淀粉酶活力極為重要。

表4 提取時間對胰淀粉酶酶活力的影響

2.1.4 提取溫度對胰淀粉酶酶活力的影響。

酶作為一種生物催化劑，其半衰期短，易失活，嚴(yán)重影響酶的使用。所以提取時溫度過高過低會對胰淀粉酶活力產(chǎn)生影響。對提取溫度做出研究。由表5可知，不同溫度下提取胰淀粉酶差異極顯著（p＜0.01），提取溫度為4～40 ℃時，胰淀粉酶活力變化明顯（p＜0.01），溫度40 ℃時，胰淀粉酶活力到達(dá)最高值，溫度再次升高至45 ℃時，胰淀粉酶活力急劇下降（p＜0.01），說明提取溫度對胰淀粉酶活力極為重要。因為40 ℃時胰淀粉酶活力達(dá)到最高值，所以最適提取溫度為40 ℃。

表5 提取溫度對胰淀粉酶酶活力的影響

2.1.5 正交試驗結(jié)果

根據(jù)表1豬胰淀粉酶提取單因素正交試驗水平表）所得表6（豬胰淀粉酶提取單因素正交試驗方案）。

由單因素結(jié)果表明，提取劑采用澄清石灰水、磷酸鹽緩沖液、水；提取pH 6.8～7.0；提取溫度30～40℃；提取時間1～4 h，通過L9(34)正交試驗確定最佳的提取工藝。根據(jù)表6的數(shù)據(jù)顯示，影響胰淀粉酶活力的因素主次為：提取劑＞提取pH＞提取溫度＞提取時間。通過極差分析得到的優(yōu)化方案為A1B2C1D3，即：提取劑采用磷酸鹽緩沖液，提取pH 6.8，提取時間2 h，提取溫度30 ℃。

表6 豬胰淀粉酶提取單因素正交試驗方案

根據(jù)正交試驗結(jié)果，提取劑采用磷酸鹽緩沖液、提取pH 6.8、提取時間2 h，提取溫度30 ℃進(jìn)行工藝驗證，驗證結(jié)果表明，胰淀粉酶酶活力為1 375.00 U/mL，比表6（豬胰淀粉酶提取單因素正交試驗方案）中提取工藝的胰淀粉酶酶活力都要高，所以提取劑采用磷酸鹽緩沖液、提取pH 6.8、提取時間2 h，提取溫度30 ℃為最佳工藝。

2.2 透析濃縮的影響

用30%聚乙二醇20000溶液進(jìn)行反滲透濃縮，透析液2～3 h后換透析液：第1次透析，胰淀粉酶記為酶2；5～6 h后再次換透析液，記為第2次透析，胰淀粉酶記為酶3；換完透析液后將樣液放入4 ℃條件下，進(jìn)行過夜透析，過夜透析后的酶為記為酶3；經(jīng)過過夜透析后的胰淀粉酶小分子物質(zhì)已透析完全，胰淀粉酶記為酶4；提取后的胰淀粉酶記為酶1。如圖1所示。

結(jié)果表明，酶在透析濃縮過程中胰淀粉酶酶活力越來越高，隨著透析次數(shù)增加，酶4平均胰淀粉酶酶活力是酶1平均胰淀粉酶酶活力的5.2倍。

圖1 不同程度透析濃縮對酶活力的影響

2.3 穩(wěn)定保存的確定

加入穩(wěn)定劑配方，放在35 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，每隔一段時間測1次酶活，觀察胰淀粉酶酶活力變化，因為胰淀粉酶是液體酶，在高于常溫下液體易變質(zhì)，產(chǎn)生難聞臭味，故在原配方的基礎(chǔ)上加入甘油防止腐敗變質(zhì)，產(chǎn)生臭味。

2.3.1 原配方

配方一[13-15]：淀粉0.01 g/mL、乳糖0.09 g/mL、糊精0.01 g/mL、氯化鈣1.5 mg/mL、氯化鈉0.1 mg/mL。

配方二[14-15]：硝酸鉀0.1 mg/mL、甘油0.05 g/mL、D-山梨醇0.05 g/mL、葡糖糖0.05 g/mL、海藻糖0.05 g/mL。

2.3.2 改進(jìn)配方

配方一：淀粉0.01 g/mL、乳糖0.09 g/mL、糊精0.01 g/mL、氯化鈣1.5 mg/mL、氯化鈉0.1 mg/mL、甘油0.025 g/L。

配方二：硝酸鉀0.1 mg/mL、甘油0.075 g/mL、D-山梨醇0.05 g/mL、葡糖糖0.05 g/mL、海藻糖0.05 g/mL。

圖2 加入穩(wěn)定劑配方酶活力的保存率

劉晶晶[13]和聶國興等[14]研究表明，添加穩(wěn)定助劑或者無機(jī)離子成分在一定含量范圍內(nèi)可以激活胰淀粉酶活力，認(rèn)為穩(wěn)定劑配方內(nèi)含有這些物質(zhì)，所以胰淀粉酶活力增高。加入穩(wěn)定劑配方后，在溫度35 ℃條件下，隨著時間加長，配方一保存24 h，胰淀粉酶酶活力升高，但保存48 h后胰淀粉酶酶活力保存率為99.60%，保存144 h后，胰淀粉酶酶活力保存率1%，近失活狀態(tài)。配方二和配方一相同，保存24 h胰淀粉酶酶活力升高，但超過24 h后，配方二胰淀粉酶酶活力開始下降，保存144 h，胰淀粉酶酶活力仍保存89.70%的酶活。

由圖3可知，隨著溫度上升胰淀粉酶保存的酶活力下降越快，25與35 ℃相比，保存時間168 h時，25℃胰淀粉酶酶活力的存活率為90.08%，而35 ℃則下降到78.30%。下降速度，30與35 ℃胰淀粉酶酶活力的下降速度相近，但30，35和25 ℃相比，25 ℃時胰淀粉酶酶活力下降速度緩慢較明顯。所以溫度越低胰淀粉酶的酶活力保存時間越長，且胰淀粉酶酶活力下降速度越慢。

圖3 配方二不同溫度下保存酶活的保存率

3 結(jié)論

通過對豬胰臟中胰淀粉酶的提取的單因素及其穩(wěn)定性的研究，確定對胰淀粉酶活力最大的因素是提取劑，其次是提取pH，影響最小的是提取溫度。確定最佳工藝為：原料采用冷凍豬胰臟，提取劑采用磷酸鹽緩沖液，提取pH 6.8，提取時間2 h，提取溫度30 ℃，用透析袋方法對粗酶進(jìn)行反滲透濃縮，酶活力比粗酶的酶活力高5.2倍。加入穩(wěn)定劑配方為：硝酸鉀0.1 mg/mL、甘油0.075 g/mL、D-山梨醇0.05 g/mL、葡糖糖0.05 g/mL、海藻糖0.05 g/mL。在35 ℃條件下，胰淀粉酶能保存近1周，保存率89.7%。胰淀粉酶保存溫度越低胰淀粉酶的酶活力保存時間越長，且胰淀粉酶酶活力下降速度越慢。此方法簡單易操作，時間短，成本低，環(huán)保、易于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。在酶穩(wěn)定性保存中有些物質(zhì)利于酶活增高，可以考慮在提取過程中加入，此方法有待研究。