王有娣，馮鈺舒，唐旗羚，賀彥，鐘銘君，徐娟娟

中山大學(xué)新華學(xué)院藥學(xué)院（廣州 510520）

染料木素（結(jié)構(gòu)見圖1）作為一種植物雌激素，主要存在于豆科植物中，如大豆、槐角、赤豆、山豆根中。

圖1 染料木素結(jié)構(gòu)圖

有研究表明染料木素具有雌激素性質(zhì)，可以抗氧化、誘發(fā)細(xì)胞程序性死亡、提高抗癌藥效、抑制血管生成等[1-2]。作為一種癌癥的潛在化學(xué)預(yù)防劑，染料木素抗癌作用及機(jī)制具有廣泛的應(yīng)用前景[3]。有研究指出，染料木素與金屬離子形成配合物后可以提高其生物利用度，增強其抗癌、抗氧化等活性[4-5]。課題組前期已經(jīng)對染料木素及其鋅配合物對乳腺癌和肺癌的體外抗癌活性進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示染料木素及其配合物對乳腺癌和肺癌均有良好的抗癌活性。根據(jù)目前已有的文獻(xiàn)來看，染料木素-鋅配合物的研究雖已有報道，但采用正交試驗優(yōu)化染料木素-鋅配合物合成工藝還鮮見報道，故試驗利用正交試驗優(yōu)選出染料木素-鋅配合物的合成工藝條件，為天然產(chǎn)物染料木素的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

集熱恒溫加熱磁力攪拌器（DF-1015型，鄭州長城科工貿(mào)）；紫外可見分光光度計（UV-2201，日本島津公司）；傅里葉紅外光譜儀（Nicolet 5700，美國Thermo Nicolet）；電子天平（AUY120型，日本島津公司）。

染料木素購自南京狄格爾醫(yī)藥科技有限公司（產(chǎn)品批號D2017042503A，純度為99.8%），無水乙醇、醋酸鋅、三乙胺等試劑均為分析純。

1.2 方法

稱取染料木素，用10倍量的無水乙醇作為反應(yīng)溶劑，加熱溶解，待染料木素完全溶解后，加入三乙胺調(diào)節(jié)反應(yīng)pH，待反應(yīng)pH穩(wěn)定，加入醋酸鋅，控制反應(yīng)溫度，回流攪拌一定時間，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)液冷卻至室溫，以3 000 r/min離心2 min，沉淀用50%乙醇洗滌，洗滌3次后，于60 ℃烘干，稱質(zhì)量，計算配合物產(chǎn)率。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 反應(yīng)溫度的確定

一般而言，升高溫度可以加快反應(yīng)速度，由于溫度太高可能會影響染料木素和金屬離子的配位能力，也可能使反應(yīng)溶劑（即無水乙醇）因為溫度過高而沸騰。如圖2所示，隨著溫度的升高，染料木素-鋅配合物產(chǎn)率也隨著增加，當(dāng)溫度在60 ℃時，產(chǎn)率最高，之后隨著溫度的升高，產(chǎn)率呈降低的趨勢。因此選擇最佳合成反應(yīng)溫度為60 ℃。

圖2 反應(yīng)溫度對產(chǎn)率的影響

2.1.2 反應(yīng)pH的確定

根據(jù)文獻(xiàn)報道黃酮類化合物在堿性條件下較容易與金屬離子進(jìn)行配合反應(yīng)，但反應(yīng)pH過高可能會導(dǎo)致金屬離子沉淀等問題[6]，故選用反應(yīng)pH 7.0～11.0進(jìn)行試驗。由圖3可知，隨著pH的增大，染料木素-鋅配合物的產(chǎn)率增加，當(dāng)反應(yīng)pH為9.0時染料木素鋅配合物產(chǎn)率最高。此后，隨著pH的增加，染料木素-鋅配合物產(chǎn)率反而下降。因此選擇最佳合成反應(yīng)pH為9.0。

圖3 反應(yīng)pH對產(chǎn)率的影響

2.1.3 反應(yīng)時間的確定

如圖3所示，增加反應(yīng)的時間，隨著反應(yīng)的逐漸完全，染料木素-鋅配合物的產(chǎn)率升高，當(dāng)反應(yīng)時間在6 h時所得染料木素鋅配合物產(chǎn)率最高，繼續(xù)延長反應(yīng)時間，染料木素-鋅配合物的產(chǎn)率開始下降。因此選擇最佳合成反應(yīng)時間為6 h。

2.2 正交試驗設(shè)計結(jié)果

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，選擇反應(yīng)溫度（A）、反應(yīng)pH（B）、反應(yīng)時間（C）三個因素作為考察的因素，每個因素選取三個水平，以染料木素鋅配合物產(chǎn)率為衡量指標(biāo)。因素水平表見表1。

圖4 反應(yīng)時間對產(chǎn)率的影響

表1 正交試驗因素水平表

采用L9(34)進(jìn)行正交試驗，正交試驗結(jié)果見表2，方差分析表見表3。從表2正交試驗直觀分析結(jié)果可以看出，各因素對配合物產(chǎn)率的影響程度不同，三個因素對產(chǎn)率的影響由大到小依次為反應(yīng)pH（B）＞反應(yīng)溫度（A）＞反應(yīng)時間（C）。從表3方差分析結(jié)果可以看出，三個因素對產(chǎn)率均無顯著性影響。結(jié)合直觀分析和方差分析結(jié)果，篩選出的染料木素鋅配合物的最優(yōu)合成方案為B2A2C2，即稱取染料木素，用10倍量的無水乙醇溶解，60 ℃加熱至完全溶解后滴加三乙胺，調(diào)節(jié)pH 9.0，pH穩(wěn)定后加入醋酸鋅，控制反應(yīng)溫度為60 ℃，回流攪拌6 h。

表2 L9(34)正交試驗結(jié)果

表3 正交試驗方差分析結(jié)果

2.3 合成工藝的驗證

根據(jù)正交試驗的結(jié)果，在最優(yōu)的合成工藝B2A2C2條件下進(jìn)行3次平行試驗，通過配合物的產(chǎn)率驗證最優(yōu)合成工藝的可行性和合理性。試驗結(jié)果顯示，用反應(yīng)pH 9.0、反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時間6 h的B2A2C2反應(yīng)方案合成染料木素-鋅配合物，產(chǎn)率為39.67%，合成得到的染料木素-鋅配合物為淡黃色粉末。

2.4 染料木素-鋅配合物的紫外光譜分析

將染料木素配體和染料木素-鋅配合物進(jìn)行紫外光譜分析，紫外光譜數(shù)據(jù)見表4。染料木素的特征紫外吸收峰為帶Ⅰ352 nm和帶Ⅱ269 nm，染料木素-鋅配合物的兩個吸收峰均向長波方向移動至381和299 nm。主要原因可能是染料木素和鋅形成配合物是通過4位羰基、5位羥基和金屬鋅形成配位鍵，整個配合物分子的平面型增強，增大了共軛體系，故吸收帶Ⅰ和Ⅱ會發(fā)生紅移。紫外光譜結(jié)果可初步證明染料木素分子中的4位羰基和5位羥基參與了金屬配位。

表4 染料木素-鋅配合物的紫外光譜數(shù)據(jù) nm

2.5 染料木素-鋅配合物的紅外光譜分析

將染料木素配體和染料木素-鋅配合物進(jìn)行紅外光譜分析，其紅外光譜數(shù)據(jù)見表5。染料木素的羥基吸收峰在3 411 cm-1左右，而鋅配合物的羥基吸收峰移動至3 380 cm-1左右，原因可能是由5-OH參與配位引起的。染料木素的4位羰基峰在1 653 cm-1左右，而鋅配合物的4位羰基峰在1 642 cm-1左右，向低波數(shù)移動，可能是由于4位羰基也參與了配位。與配體染料木素相比，配合后化合物在460 cm-1左右新增加了一個吸收峰，推測該峰可能是由金屬Zn與O形成的Zn-O鍵伸縮振動引起的。紅外光譜結(jié)果也可說明染料木素分子中的4位羰基和5位羥基參與了金屬配位。

表5 染料木素-鋅配合物的紅外光譜數(shù)據(jù)

3 討論

植物雌激素具有雌激素激動劑和阻斷劑效應(yīng)，對乳腺癌、前列腺癌、心血管病變等激素相關(guān)疾病的預(yù)防和治療有良好的作用[7]。染料木素是一種異黃酮類的植物雌激素，課題組前期已經(jīng)研究了染料木素及其鋅配合物對乳腺癌和肺癌的體外抗癌活性，結(jié)果顯示染料木素及其配合物對乳腺癌和肺癌均有良好的抗癌活性，且染料木素-鋅配合物的抗癌活性高于其配體染料木素[8]。

由染料木素本身的結(jié)構(gòu)以及試驗前的pH試紙測定顯示，染料木素呈酸性，故染料木素在酸性環(huán)境中較穩(wěn)定，與金屬離子配位的能力較差，容易造成產(chǎn)率較低的問題。在強堿性條件下，染料木素與金屬離子反應(yīng)形成配合物的能力強，但堿性過強則容易造成染料木素的開環(huán)或者氧化，同時如果反應(yīng)環(huán)境的pH過高也容易造成金屬離子的沉淀。因此，綜合考慮各種因素確定最終選定染料木素-鋅配合物的合成pH范圍為7.0～11.0，試驗的結(jié)果也證明在pH 9.0時，反應(yīng)產(chǎn)率最高。通過對正交試驗結(jié)果的分析可知，影響產(chǎn)率的主要因素依次為pH（B）＞反應(yīng)溫度（A）＞反應(yīng)時間（C），主要因素應(yīng)取最好的水平，而次要因素則可根據(jù)成本、時間等方面考慮，由此得到各因素的最佳搭配為B2A2C2，即反應(yīng)pH為9.0、反應(yīng)溫度為60 ℃、反應(yīng)時間6 h。

4 結(jié)論

采用正交試驗考察了不同因素對染料木素-鋅配合物產(chǎn)率的影響。結(jié)果顯示，染料木素-鋅配合物的最佳合成工藝為：反應(yīng)pH 9.0、反應(yīng)溫度60 ℃、反應(yīng)時間6 h。在此條件下染料木素-鋅配合物的平均產(chǎn)率可達(dá)39.67%。同時試驗分析結(jié)果表明，三個影響因素中反應(yīng)環(huán)境的pH對合成產(chǎn)率影響最大。對比染料木素與醋酸鋅配合前后的紫外光譜和紅外光譜可知，染料木素是通過4位羰基和5位羥基與鋅金屬離子進(jìn)行配位的。