郭建華,焦云娟,霍溢徽,段楊鑫婷,何深宏,劉 威,任紹科,羅獻(xiàn)梅,虞榮華,程方俊? (.西南大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,重慶 榮昌40460;.加拿大卡爾加里大學(xué) 醫(yī)學(xué)院,阿爾伯塔卡爾加里TN 4N)

鐵因?yàn)閰⑴c了電子傳遞、DNA 合成、氧氣輸送、酶的輔酶等重要生理活動(dòng),廣泛存在于幾乎所有的從低等到高等的生物細(xì)胞中,沒(méi)有鐵就沒(méi)有生命。鐵雖然廣泛存在地殼中,但在宿主動(dòng)物體內(nèi),沒(méi)有自由的鐵供細(xì)菌利用,所以病原菌進(jìn)化出一系列途徑從宿主獲得鐵。一些巴氏桿菌科和奈氏菌科的細(xì)菌能產(chǎn)生轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白(transferrin binding protein,Tbp),Tbp進(jìn)而“劫持”宿主轉(zhuǎn)鐵蛋白的鐵,供細(xì)菌利用。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體包含轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白A(transferrin binding protein A,Tbp A)和轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白B(transferrin binding protein B,Tbp B),一般認(rèn)為T(mén)bpB先識(shí)別并結(jié)合轉(zhuǎn)鐵蛋白(transferrin,Tf),然后使轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合Tbp A,然后通過(guò)Tbp A 將轉(zhuǎn)鐵蛋白的鐵傳輸?shù)郊?xì)菌的周質(zhì)空間進(jìn)而穿過(guò)內(nèi)膜進(jìn)入細(xì)菌[1-2]。相比脫鐵轉(zhuǎn)鐵蛋白,Tbp B 對(duì)結(jié)合了鐵的轉(zhuǎn)鐵蛋白有更強(qiáng)的結(jié)合力,這表明TbpB 在與轉(zhuǎn)鐵蛋白識(shí)別中占有更重要的角色[3-4]。

各種來(lái)源的TbpB 在結(jié)構(gòu)上有保守性,與轉(zhuǎn)鐵蛋白一樣,它也具有2個(gè)小葉組成:氨基端小葉(Nlobe)和羧基端小葉(C-lobe),其相對(duì)分子質(zhì)量通常在60 000到100 000。Tbp B作為外膜蛋白,成為良好的疫苗設(shè)計(jì)靶點(diǎn)。目前的報(bào)道中,有的轉(zhuǎn)鐵蛋白的N-lobe和C-lobe均參與了與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的結(jié)合,如在?？ㄋ?Moraxella catarrhalis)Tbp B與牛轉(zhuǎn)鐵蛋白反應(yīng)中,而在人的奈氏菌中是人轉(zhuǎn)鐵蛋白的C-lobe參與了與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體B 的結(jié)合[5-6]。

海藻糖比伯斯坦桿菌(Bibersteinia trehalosi)為巴氏桿菌科比伯斯坦桿菌屬。根據(jù)分解阿拉伯糖和海藻糖能力的不同,海藻糖比伯斯坦桿菌最初被分為溶血性巴氏桿菌T 生物型(Pasteurella haemolyticabiotypeT)[7-8]。該菌是引起山羊呼吸道疾病重要病原菌之一[7,9-10],通過(guò)生物信息學(xué)分析該菌含有轉(zhuǎn)鐵蛋白受體,但其克隆表達(dá)與功能鑒定還未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)分離自重慶榮昌的1株山羊源海藻糖比伯斯坦桿菌,對(duì)其TbpB序列分析的基礎(chǔ)上,預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)模型,分別設(shè)計(jì)引物克隆、表達(dá)和純化其完整蛋白(In-tact)、N-lobe、C-lobe蛋白,并通過(guò)與山羊轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合試驗(yàn)驗(yàn)證其功能,為下一步研究其鐵吸收途徑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源2018年4月重慶榮昌某山羊養(yǎng)殖場(chǎng)的羊只發(fā)病死亡,剖檢可見(jiàn)肺部出血、壞死等病理變化。無(wú)菌采集肺臟接種于鮮血培養(yǎng)基中,37℃恒溫培養(yǎng)24 h,分離純化獲得1株細(xì)菌命名為grc184。通過(guò)生理生化試驗(yàn)、16S r DNA、白細(xì)胞毒素蛋白、RNA 聚合酶β亞基序列分析等方法鑒定為海藻糖比伯斯坦桿菌(其結(jié)果另文發(fā)表)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與PCR 擴(kuò)增根據(jù)Tbp B 基因兩邊保守序列,設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增、測(cè)序,得到Tbp B全序列,進(jìn)行結(jié)構(gòu)模擬分析得到Tbp B N-lobe部分和C-lobe部分,設(shè)計(jì)引物分別擴(kuò)增海藻糖比伯斯坦桿菌Tbp B20-581(In-tact)、N-lobe和C-lobe,引物序列如表1所示,引物下劃線是引入的限制性酶切位點(diǎn)。

表1 本研究所用引物序列

1.3 序列特征與進(jìn)化分析將序列轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)序列后,再在NCBI檢索溶血性曼氏桿菌、副豬嗜血桿菌(Haephilus parasuis)、豬胸膜肺炎放線桿菌、牛睡眠嗜血桿菌(Haemophilus somnus)、禽禽桿菌(Avibacterium avian)等TbpB,通過(guò)生物信息學(xué)軟件MEGA6.0進(jìn)行N-J系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

1.4 結(jié)構(gòu)模型預(yù)測(cè)通過(guò)SWISS 模型在線程序,以已經(jīng)發(fā)表的豬胸膜肺炎放線桿菌Tbp B晶體結(jié)構(gòu)為模板[1],進(jìn)行海藻糖比伯斯坦桿菌TbpB 三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè),保存為pdb格式。

1.5 克隆、表達(dá)與蛋白純化取1μL 制備的菌株grc184基因組DNA 為模板(大約50 ng的DNA),已合成的3 對(duì)引物于相應(yīng)的體系中分別在TaqDNA 聚合酶作用下進(jìn)行擴(kuò)增。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物水解、T4連接酶連接、轉(zhuǎn)化、鑒定按照文獻(xiàn)[1,11]進(jìn)行。質(zhì)粒是經(jīng)過(guò)改造的T7啟動(dòng)子p ET28a,組氨酸標(biāo)簽后面是麥芽糖結(jié)合蛋白(maltose binding protein,MBP)標(biāo)簽,接下來(lái)TEV 酶水解位點(diǎn)后面是連接試驗(yàn)需要克隆表達(dá)的目的蛋白。通過(guò)測(cè)序確認(rèn)后轉(zhuǎn)化于大腸桿菌ER2566感受態(tài)細(xì)胞中、涂板、菌落PCR 鑒定按照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行。同時(shí),將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌接種于STUDIER FW 開(kāi)發(fā)的培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜表達(dá)目的蛋白,該培養(yǎng)基是1種免異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、可自動(dòng)誘導(dǎo)的用于重組蛋白表達(dá)的專(zhuān)用培養(yǎng)基[12]。離心收集菌體,超聲波破碎細(xì)胞,Ni-NTA 柱純化蛋白(按照Ni-NTA 樹(shù)脂蛋白純化說(shuō)明書(shū)操作,Ta KaRa)。

1.6 蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳將純化得到的海藻糖比伯斯坦桿菌Tbp B20-581In-tact、N-lobe、C-lobe分離蛋白樣品,同時(shí)將作為對(duì)照的副豬嗜血桿菌、牛睡眠嗜血桿菌、禽禽桿菌TbpB(以上均為帶MBP的In-tact)與MBP SDS-聚丙烯酰胺凝膠100 V 電泳(濃度12%)1 h,凝膠經(jīng)過(guò)考馬斯亮藍(lán)染色,照相保存圖片。

1.7 HRP連接轉(zhuǎn)鐵蛋白將HRP 溶于無(wú)菌雙蒸水中,使其質(zhì)量濃度為4 g/L,加入0.2 m L 0.1mol/L的碘酸鈉溶液,室溫中攪拌20 min后透析除去多余的碘酸鈉,用p H9.5的碳酸鈉緩沖液調(diào)整其p H,加入-山羊轉(zhuǎn)鐵蛋白(實(shí)驗(yàn)室制備,未發(fā)表),室溫下攪拌2 h,反應(yīng)后的混合物經(jīng)過(guò)葡聚糖凝膠過(guò)濾層析得到HRP-goat Tf。

1.8 轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白特異性結(jié)合點(diǎn)陣雜交試驗(yàn)將純化的海藻糖比伯斯坦桿菌Tbp B 的In-tact、Nlobe、C-lobe連同實(shí)驗(yàn)室保存的豬胸膜肺炎放線桿菌Tbp B、牛睡眠嗜血桿菌Tbp B、禽禽桿菌Tbp B(以上均為帶MBP 的In-tact)2μL 點(diǎn)于膜上(HApaper,Milipore),干燥20 min,將膜置于暗盒,加入15 m L 用TBS緩沖液配置的1%脫脂奶溶液,分別加入適量HRP-山羊轉(zhuǎn)鐵蛋白、HRP-綿羊轉(zhuǎn)鐵蛋白、HRP-豬轉(zhuǎn)鐵蛋白、HRP-牛轉(zhuǎn)鐵蛋白、HRP-雞轉(zhuǎn)鐵蛋白,4℃震蕩過(guò)夜后,加入HRP顯色液,觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 海藻糖比伯斯坦桿菌Tbp B序列與進(jìn)化分析

海藻糖比伯斯坦桿菌Tbp B 包含1 743堿基對(duì),編碼581個(gè)氨基酸,略長(zhǎng)于豬胸膜肺炎放線桿菌Tbp B(528個(gè)氨基酸),但短于腦膜炎奈氏菌和禽禽桿菌Tbp B。海藻糖比伯斯坦桿菌Tbp B 與豬胸膜肺炎放線桿菌、腦膜炎奈氏菌、禽禽桿菌、副豬嗜血桿菌等TbpB的N-J進(jìn)化樹(shù)如圖1所示。

從圖1可以看出,我們分離海藻糖比伯斯坦桿菌菌株grc184 TbpB 與溶血性曼氏桿菌相似性最高,它們序列一致性約為85%。海藻糖比伯斯坦桿菌Tbp B與溶血性曼氏桿菌Tbp B展現(xiàn)了與其他菌株Tbp B較高的變異性。海藻糖比伯斯坦桿菌TbpB與禽禽桿菌TbpB 相似性最低,即親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。草食動(dòng)物源的海藻糖比伯斯坦桿菌、溶血性曼氏桿菌、牛莫拉氏菌、睡眠嗜血桿菌Tbp B形成1個(gè)分支,區(qū)別與人源腦膜炎奈氏菌和豬源副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌和豬放線桿菌Tbp B。

圖1 海藻糖比伯斯坦桿菌TbpB N-J進(jìn)化樹(shù)

2.2 結(jié)構(gòu)模型海藻糖比伯斯坦桿菌Tbp B蛋白三維結(jié)構(gòu)模型顯示如圖2。跟已經(jīng)發(fā)表的其他細(xì)菌的Tbp B類(lèi)似,海藻糖比伯斯坦桿菌Tbp B蛋白仍然是雙葉組成的:N-lobe 和C-lobe。圖中上面黃色是C-lobe,下面藍(lán)色是N-lobe。綠色穿過(guò)了C-lobe的線狀結(jié)構(gòu)是該蛋白的N 末端,大約60個(gè)氨基酸殘基,這60個(gè)氨基酸稱(chēng)為錨定(anchor)結(jié)構(gòu),Tbp B靠這部分結(jié)構(gòu)插入細(xì)菌的外膜。C-lobe包含744堿基對(duì),編碼248個(gè)氨基酸。N-lobe大約包含999堿基對(duì),編碼333個(gè)氨基酸。每個(gè)小葉有8條折疊鏈肽段組成β筒。

圖2 海藻糖比伯斯坦桿菌TbpB 預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)模型

2.3 蛋白克隆與表達(dá)、純化本研究中克隆的海藻糖比伯斯坦桿菌TbpB20-581In-tact是20～581位氨基酸,N-lobe是20～333位氨基酸,C-lobe是333～581位氨基酸,將表達(dá)出的海藻糖比伯斯坦桿菌Tbp B20-581In-tact、N-lobe、C-lobe進(jìn)行SDS-PAGE,為了使蛋白更穩(wěn)定,組氨酸后面有MBP,所以電泳結(jié)果是TbpB20-581In-tact、N-lobe、C-lobe分別再加MBP(約42 000)。電泳結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出Tbp B20-581In-tact加MBP 大小是106 000,TbpB N-lobe加MBP 大小約是74 000,TbpB Clobe加MBP大小約是68 000,均符合預(yù)期大小。

圖3 海藻糖比伯斯坦桿菌TbpB20-581 In-tact、N-lobe、C-lobe蛋白電泳圖 M.蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量Marker,1～3.分別為海藻糖比伯斯坦桿菌TbpB20-581 In-tact、Nlobe、C-lobe;4～7.分別為副豬嗜血桿菌TbpB、禽禽桿菌TbpB、牛睡眠嗜血桿菌TbpB和MBP作為對(duì)照

圖4 海藻糖比伯斯坦桿菌TbpB In-tact、N-lobe、C-lobe轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合點(diǎn)陣斑點(diǎn)圖 A.海藻糖比伯斯坦桿菌TbpB20-581 In-tact;B.海藻糖比伯斯坦桿菌TbpB N-lobe;C.海藻糖比伯斯坦桿菌TbpB C-lobe;D.副豬嗜血桿菌TbpB;E.禽禽桿菌TbpB;F.牛睡眠嗜血桿菌TbpB;G.MBP

2.4 特異性鑒定加入HRP 顯色液室溫反應(yīng)15 min 后,從圖4可以看出,海藻糖比伯斯坦桿菌Tbp B In-tact、N-lobe 均能與山羊轉(zhuǎn)鐵蛋白(goat transferrin,goat Tf)、綿羊轉(zhuǎn)鐵蛋白(sheep tansferrin,sheep Tf)反應(yīng),但與豬轉(zhuǎn)鐵蛋白(porcine transferring,porcine Tf)、雞轉(zhuǎn)鐵蛋白(chicken Tf,chicken Tf)均不能反應(yīng)。而海藻糖比伯斯坦桿菌TbpB的C-lobe不能與山羊轉(zhuǎn)鐵蛋白反應(yīng),也不能與豬轉(zhuǎn)鐵蛋白、牛轉(zhuǎn)鐵蛋白和雞轉(zhuǎn)鐵蛋白反應(yīng)。作為對(duì)照的副豬嗜血桿菌、牛睡眠嗜血桿菌、禽禽桿菌Tbp B 均能與各自宿主轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合。MBP 不能與所有的轉(zhuǎn)鐵蛋白有結(jié)合反應(yīng)。同時(shí)我們也注意到,海藻糖比伯斯坦桿菌Tbp B In-tact、N-lobe與牛轉(zhuǎn)鐵蛋白(bovine transferring,bovine Tf)有交叉反應(yīng),牛睡眠嗜血桿菌TbpB 與山羊和綿羊轉(zhuǎn)鐵蛋白也有弱交叉反應(yīng),這在一些其他牛病原菌如溶血性巴氏桿菌(Pasteurella haemolytica)也有報(bào)道:既能與牛的轉(zhuǎn)鐵蛋白反應(yīng),也能與山羊轉(zhuǎn)鐵蛋白反應(yīng)[13]。

3 討論

一些細(xì)菌的轉(zhuǎn)鐵結(jié)合蛋白B 是暴露于細(xì)菌外膜的蛋白,因?yàn)槭且粋€(gè)良好設(shè)計(jì)疫苗的抗原靶點(diǎn),引起廣泛的研究興趣[14],本研究在山羊源海藻糖比伯斯坦桿菌中克隆與鑒定了TbpB,證明了該菌具備轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的鐵吸收系統(tǒng),推測(cè)該菌可以在鐵缺乏環(huán)境中表達(dá)Tbp B,“劫持”宿主的鐵,為后面開(kāi)發(fā)以Tbp B為靶點(diǎn)的山羊源海藻糖比伯斯坦桿菌亞單位疫苗研發(fā)提供了理論依據(jù)。在本研究中,該菌TbpB結(jié)構(gòu)模型包含了N-lobe 和C-lobe,顯示了Tbp B三級(jí)結(jié)構(gòu)的保守性[15]。

本研究首次克隆了海藻糖比伯斯坦桿菌Tbp B并鑒定其功能?？寺×撕Ｔ逄潜炔固箺U菌TbpB全長(zhǎng)蛋白、N-lobe和C-lobe。載體采用T7 啟動(dòng)子系統(tǒng),組氨酸標(biāo)簽后面加上MBP,可以提高表達(dá)的產(chǎn)量和穩(wěn)定性。在我們研究中也發(fā)現(xiàn),如果不帶MBP,Tbp B產(chǎn)量較低,且容易水解。在后期疫苗開(kāi)發(fā)中,也可以在克隆中先表達(dá)MBP融合蛋白,再用TEV 酶水解。在克隆試驗(yàn)中,TbpB In-tact是去除了前面19個(gè)氨基酸,這也是為了讓表達(dá)的蛋白更穩(wěn)定,因?yàn)樵诳寺〔蝗コ被岬娜L(zhǎng)Tbp B時(shí),純化過(guò)程中不能得到穩(wěn)定的足夠目的蛋白。

點(diǎn)陣雜交試驗(yàn)可以很方便地檢測(cè)蛋白之間相互作用,特異性和敏感性都很高。本研究中,點(diǎn)陣雜交試驗(yàn)可以用來(lái)檢測(cè)克隆純化的目標(biāo)蛋白能否與轉(zhuǎn)鐵蛋白發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng),為了防止假陰性結(jié)果的產(chǎn)生,在進(jìn)行該試驗(yàn)時(shí)需要同時(shí)SDS-PAGE 電泳檢測(cè)蛋白質(zhì),同時(shí)使用其他細(xì)菌轉(zhuǎn)鐵蛋白受體作為對(duì)照。在本研究中,海藻糖比伯斯坦桿菌Tbp B的Intact和N-lobe均能與山羊轉(zhuǎn)鐵蛋白特異結(jié)合,而Clobe不能與山羊轉(zhuǎn)鐵蛋白特異結(jié)合,證明了海藻糖比伯斯坦桿菌這個(gè)基因編碼的蛋白可能參與了鐵的傳遞,而且與山羊轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合的位點(diǎn)在N-lobe上,這與相關(guān)報(bào)道是一致的[1]。而C-lobe不參與鐵的傳遞。我們可以同時(shí)發(fā)現(xiàn),海藻糖比伯斯坦桿菌TbpB也能與牛轉(zhuǎn)鐵蛋白發(fā)生弱交叉反應(yīng),在有些草食動(dòng)物來(lái)源的細(xì)菌轉(zhuǎn)鐵蛋白受體中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似現(xiàn)象,如導(dǎo)致牛紅眼病的牛溶血性巴氏桿菌(Pasteurella haemolytica)[13],這也在提示我們,可能開(kāi)發(fā)同時(shí)免疫多種動(dòng)物的基于轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的亞單位疫苗。