李福利，夏咸軍，劉洪，方征，趙海濱，羅昆侖

（中國(guó)人民解放軍聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇四醫(yī)院 1.肝膽外科 2.病理科，江蘇 無(wú)錫 214044）

膽囊癌是一種惡性程度極高的膽道系統(tǒng)惡性腫瘤，其病情隱匿，預(yù)后極差，嚴(yán)重威脅患者生命健康，其發(fā)生、發(fā)展是多基因、多步驟病理信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的復(fù)雜過(guò)程，其中，癌基因的激活為該過(guò)程中重要環(huán)節(jié)之一[1-2]。靶向治療是近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，但目前有效的膽囊癌靶向藥物極少，因此迫切需要尋找膽囊癌治療的新靶點(diǎn)[3-4]。高爾基磷酸化蛋白3（GOLPH3）是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的新癌基因，其能通過(guò)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）通路促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5-6]。另外，血管生成是腫瘤生長(zhǎng)、增殖及轉(zhuǎn)移的先決條件，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是一種高度特異的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，通過(guò)誘導(dǎo)血管新生，它在腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7-8]。微血管密度（MVD）計(jì)數(shù)對(duì)評(píng)價(jià)血管生成具有重要意義[9]。目前關(guān)于GOLPH3在膽囊癌中的表達(dá)及其與腫瘤血管形成的關(guān)系國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)，本研究通過(guò)檢測(cè)膽囊癌標(biāo)本中GOLPH3、VEGF的表達(dá)及MVD計(jì)數(shù)，探討它們與膽囊癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為膽囊癌的臨床治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

收集聯(lián)勤保障部隊(duì)第九0四醫(yī)院2010年1月—2018年12月手術(shù)切除的膽囊癌標(biāo)本80例，其中男24例，女56例；年齡36～87歲，平均年齡63.4歲。術(shù)前均未行放化療且病例資料完整。按照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)2010病理分期標(biāo)準(zhǔn)，I期患者6例，II期10例，III期35例，IV期29例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例；腫瘤高分化14例，中分化29例，低分化37例；組織類(lèi)型分類(lèi)：腺癌72例，腺鱗癌8例。對(duì)照組為我院同期手術(shù)切除的30例慢性膽囊炎標(biāo)本。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施。

1.2 免疫組化檢測(cè)GOLPH3、VEGF的表達(dá)及MVD

組織石蠟包埋后切片，切片厚約4 μm，應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法染色檢測(cè)GOLPH3（GOLPH3單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，工作濃度1:400）與VEGF（VEGF單克隆抗購(gòu)自Abcam公司，工作濃度1:100）的表達(dá)及CD34（CD34單克隆抗購(gòu)自Abcam公司，工作濃度1:200）標(biāo)記的MVD（其他試劑及設(shè)備均由我院病理科提供）。以已知陽(yáng)性組織切片作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定

GOLPH3主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及部分細(xì)胞核，VEGF主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，由2名高年資病理科醫(yī)師進(jìn)行切片觀察，均以細(xì)胞質(zhì)染色為判定陽(yáng)性細(xì)胞指標(biāo)，參照Simons[10]評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，采用半定量法，隨機(jī)計(jì)數(shù)5個(gè)高倍鏡視野，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比及陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)弱分別計(jì)分。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比＜1%、1%～30%、31%～75%、＞75%分別定為0、1、2、3分，根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)弱定為：無(wú)著色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；棕褐色為3分。兩項(xiàng)相加0～2分為陰性（-），≥3分為陽(yáng)性（+）。MVD測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)：以血管內(nèi)皮細(xì)胞呈棕黃色染色作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，參照Weidner等[9]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，將被CD34染成棕黃色的單個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞團(tuán)或與其不相連的分枝結(jié)構(gòu)作為一個(gè)微血管計(jì)數(shù)，先在低倍鏡下選擇5個(gè)血管密度最高區(qū)域，然后在高倍鏡下（×200）計(jì)數(shù)每個(gè)視野微血管數(shù)，取其均數(shù)作為該標(biāo)本的MVD值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，多組樣本均數(shù)比較采用方差分析；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)；生存分析采用Kaplan-Meier法并繪制生存曲線，并進(jìn)行Log-rank檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GOLPH3、VEGF表達(dá)及MVD檢測(cè)結(jié)果

GOLPH3主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及部分細(xì)胞核，VEGF主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，CD34標(biāo)記的MVD主要見(jiàn)于血管內(nèi)皮細(xì)胞（圖1）。GOLPH3在膽囊癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于慢性膽囊炎組織（χ2=28.476，P＜0.05）；VEGF在膽囊癌組織中的陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于慢性膽囊炎組織（χ2=29.220，P＜0.05）；80例膽囊癌標(biāo)本MVD平均值為47.36±13.08，30例慢性膽囊炎標(biāo)本MVD平均值為26.97±7.31，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=8.066，P＜0.05）（表1）。

2.2 GOLPH3、VEGF表達(dá)及MVD計(jì)數(shù)與膽囊癌患者臨床病理特征的關(guān)系

分析結(jié)果顯示，GOLPH3的陽(yáng)性表達(dá)率與患者癌組織的分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期明顯有關(guān)（均P＜0.05），而與患者的性別、年齡、組織類(lèi)型無(wú)關(guān)（均P＞0.05）；VEGF陽(yáng)性表達(dá)率與患者的性別、年齡、組織類(lèi)型、分化程度無(wú)關(guān)（均P＞0.05），而與癌組織有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)(P＜0.05)。MVD計(jì)數(shù)與膽囊癌的分化程度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期有關(guān)（均P＜0.05），而與患者的性別、年齡、組織類(lèi)型無(wú)關(guān)（均P＞0.05）（表2）。

圖1 免疫組化檢測(cè)GOLPH3、VEGF表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)（×200，標(biāo)尺：300 μm）Figure 1 Immunohistochemical staining for GOLPH3 and VEGF expressions and MVD counts (×200, bar: 300 μm)

表1 兩種組織中GOLPH3、VEGF表達(dá)及MVD計(jì)數(shù)的比較Table 1 Comparison of the expressions of GOLPH3 and VEGF and MVD counts between the types of tissues

表2 GOLPH3、VEGF表達(dá)及MVD計(jì)數(shù)與膽囊癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]Table 2 Relations of GOLPH3 and VEGF expressions and MVD count with the clinicopathologic variables of the gallbladder carcinoma patients [n (%)]

2.3 膽囊癌組織中OLPH3、VEGF表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)的相關(guān)性

Spearman等級(jí)相關(guān)分析結(jié)果顯示，GOLPH3與VEGF在80例膽囊癌中的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.437，P＜0.05）（表3）。在80例膽囊癌患者中，GOLPH3陽(yáng)性者M(jìn)VD平均值為51.45±13.78，GOLPH3陰性者M(jìn)VD平均值為40.17±7.71，隨著GOLPH3表達(dá)增高，膽囊癌組織中MVD也增加，兩者呈正相關(guān)（r=0.416，P=0.000）（表4）；VEGF陽(yáng)性者M(jìn)VD平均值為50.54±13.09，VEGF陰性者M(jìn)VD平均值為38.43±8.08，隨著VEGF表達(dá)增高，膽囊癌組織中MVD也增加，兩者呈正相關(guān)（r=0.433，P=0.000）（表5）。

表3 GOLPH3與VEGF在膽囊癌組織中表達(dá)的相關(guān)性分析關(guān)系Table 3 Correlation analysis between GOLPH3 and VEGF expressions in gallbladder carcinoma tissue

表4 GOLPH3表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)在膽囊癌組織中的相關(guān)性分析關(guān)系Table 4 Correlation analysis between GOLPH3 expression and MVD count in gallbladder carcinoma tissue

表5 VEGF表達(dá)與MVD計(jì)數(shù)在膽囊癌組織中的相關(guān)性分析關(guān)系Table 5 Correlation analysis between VEGF expression and MVD count in gallbladder carcinoma tissue

2.4 GOLPH3、VEGF與MVD與膽囊癌患者預(yù)后的關(guān)系

行電話、信件方式隨訪膽囊癌患者的生存情況，隨訪截止日期為2019年7月，全組隨訪時(shí)間1～46個(gè)月，中位隨訪時(shí)間10個(gè)月，其中71例患者死亡，9例患者至隨訪時(shí)間結(jié)束仍存活。Kaplan-Meier生存分析顯示：GOLPH3陽(yáng)性組中位生存時(shí)間為8個(gè)月，GOLPH3陰性組中位生存時(shí)間為12個(gè)月，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.3 0 0，P=0.021）（圖2A）；VEGF陽(yáng)性組中位生存時(shí)間為8個(gè)月，VEGF陰性組中位生存時(shí)間為17個(gè)月，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=6.0 2 3，P=0.014）（圖2B）。以80例膽囊癌標(biāo)本MVD的均數(shù)為界，將患者分為高M(jìn)VD組與低MVD組，高M(jìn)VD組中位生存時(shí)間為6個(gè)月，低MVD組中位生存時(shí)間為15個(gè)月，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=11.986，P=0.001）（圖2C）。

圖2 不同特征膽囊癌患者生存曲線 A：GOLPH3陽(yáng)性與陰性表達(dá)患者；B：VEGF陽(yáng)性及陰性表達(dá)患者；C：高M(jìn)VD計(jì)數(shù)與低MVD計(jì)數(shù)癌患Figure 2 Survival curves of gallbladder cancer patients with different characteristics A: Patients with positive and negative GOLPH3 expressions; B: Patients with positive and negative VEGF expressions; C: Patients with high MVD count and low MVD count

3 討 論

GOLPH3是一種分子量大小約34 000的高爾基體復(fù)合物相關(guān)蛋白，是反面高爾基體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)（TGN）家族的一員，它最初是從大鼠肝高爾基體蛋白質(zhì)組學(xué)分析中被發(fā)現(xiàn)的，并且在蛋白質(zhì)加工、受體回收和糖基化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[11-12]。GOLPH3基因位于人染色體5p13上，該染色體區(qū)域與多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[13]，最近研究顯示GOLPH3通過(guò)刺激mTOR通路、提高蛋白激酶B（Akt）活性及減低轉(zhuǎn)錄因子FOXO1轉(zhuǎn)錄活性促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖，可能是一種新的癌基因[14]。GOLPH3通過(guò)介導(dǎo)多種糖基化蛋白酶的定位功能促進(jìn)腫瘤相關(guān)蛋白的分泌，有利于癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移[15]。此外，Wen等[16]的研究顯示，敲除GOLPH3基因不僅能夠抑制腫瘤細(xì)胞株增殖，促進(jìn)其凋亡，還可以通過(guò)調(diào)節(jié)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，反之，GOLPH3的過(guò)表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞株的增殖與遷移。目前GOLPH3在多種腫瘤如肺癌[17]、胃癌[14]等的表達(dá)研究已有相關(guān)報(bào)導(dǎo)。本研究首次證明GOLPH3在膽囊癌組織高表達(dá)，并且GOLPH3的陽(yáng)性表達(dá)與膽囊癌的分化程度、TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，說(shuō)明GOLPH3在膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程中同樣起重要作用。另外，有研究[18-20]顯示GOLPH3的高表達(dá)也影響腫瘤的預(yù)后。本研究中也顯示，GOLPH3與膽囊癌的不良預(yù)后相關(guān)，提示GOLPH3蛋白的表達(dá)情況可以作為膽囊癌不良預(yù)后的預(yù)測(cè)因素。

血管生成與腫瘤的生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，介導(dǎo)腫瘤血管生成的因子眾多，其中最重要因子是VEGF，VEGF通過(guò)與內(nèi)皮細(xì)胞膜上的特異性受體VEGFR結(jié)合，啟動(dòng)一系列細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)從而提高血管通透性、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及血管新生[7]。李洪波等[21]通過(guò)檢測(cè)膽囊癌組織與膽囊息肉組織中VEGF蛋白的表達(dá)發(fā)現(xiàn)膽囊癌組織中VEGF表達(dá)率遠(yuǎn)高于膽囊息肉組，本研究中，膽囊癌組織中VEGF蛋白表達(dá)也遠(yuǎn)高于慢性膽囊炎組，這與上述報(bào)導(dǎo)一致。另外，本研究中VEGF的陽(yáng)性表達(dá)還與膽囊癌的TNM分期、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，這與趙敏等[22]的研究結(jié)果基本一致。此外，腫瘤的生長(zhǎng)越快，所需血流灌注所提供的營(yíng)養(yǎng)越多，新生血管生成就越多，血管密度越大[23]。因此，通過(guò)檢測(cè)腫瘤組織MVD的表達(dá)，對(duì)指導(dǎo)腫瘤患者的進(jìn)一步治療具有重要意義。關(guān)于腫瘤MVD的研究國(guó)內(nèi)外均屢有報(bào)導(dǎo)[24-27]。本研究中使用CD34標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞測(cè)量膽囊癌組織的MVD，結(jié)果MVD不僅在膽囊癌組織中高表達(dá)，并與其不良預(yù)后相關(guān)。這與國(guó)內(nèi)白濤等[28]的研究一致。

mTOR信號(hào)通路在調(diào)節(jié)人體腫瘤細(xì)胞增殖、分化及轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[29-30]。有研究[31]顯示mTOR信號(hào)通路的活化可以上調(diào)缺氧誘導(dǎo)因子1a（HIF-1a）的表達(dá)促進(jìn)VEGF表達(dá)，進(jìn)而刺激內(nèi)皮細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)血管新生增加腫瘤血供。GOLPH3通過(guò)mTOR復(fù)合物mTORC1和mTORC2底物磷酸化或絲氨酸磷酸化位點(diǎn)（Ser473）磷酸化激活A(yù)KT直接或間接激活磷酸肌醇三激酶（PI3K）/Akt/mTOR信號(hào)通路[5]，有可能參與腫瘤血管生成。本研究結(jié)果顯示膽囊癌組織中GOLPH3與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，并且GOLPH3與VEGF均與膽囊癌MVD呈正相關(guān)，隨著膽囊癌的發(fā)展GOLPH3與VEGF表達(dá)增高，相應(yīng)的腫瘤MVD也增加。提示GOLPH3有可能通過(guò)誘導(dǎo)VEGF表達(dá)共同促進(jìn)膽囊癌的血管形成及其發(fā)生發(fā)展，但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究。

綜上所述，GOLPH3與VEGF的表達(dá)與膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展及血管形成密切相關(guān)，通過(guò)對(duì)它們?cè)谀懩野┲斜磉_(dá)的研究，為進(jìn)一步揭示膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制提供了一個(gè)理論基礎(chǔ)。此外，本研究中，GOLPH3、VEGF與MVD均與患者的不良預(yù)后相關(guān)，因此，監(jiān)測(cè)它們?cè)谀懩野┙M織的表達(dá)水平有助于判斷患者的預(yù)后。通過(guò)抑制GOLPH3或VEGF在膽囊癌中的表達(dá)，減少腫瘤血管形成，有可能阻止或延緩膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展，改善患者不良預(yù)后，本研究也為膽囊癌的靶向治療提供了一個(gè)新思路。