劉倩宇 ，劉穎超 ，董豐收 ，徐軍 ，吳小虎 ，劉新剛 ，鄭永權

（1.河北農業(yè)大學，河北省植物生理與分子病理學重點實驗室，河北保定 071001；2.中國農業(yè)科學院植物保護研究所，植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

桃（Prunus persicaL.）肉質鮮美，含有豐富的維生素、礦物質和果酸，具有很高的營養(yǎng)價值和醫(yī)療保健作用[1]。褐腐病是一種危害桃樹的世界性病害，其傳播快、分布廣，成熟期發(fā)病最多，嚴重影響桃果產量和品質[2]。吡唑醚菌酯和啶酰菌胺對桃褐腐病具有良好的防效[3-4]。實際生產中，該藥劑在桃樹坐果期大量應用。因此，開展關于吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃果中殘留行為的研究具有重要意義。

吡唑醚菌酯（pyraclostrobin）是一種甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑，通過阻止細胞色素b和C1間的電子傳遞，抑制線粒體呼吸作用，從而破壞病原菌能量循環(huán)進而導致細胞死亡[5]。啶酰菌胺（boscalid）是一種煙酰胺類廣譜殺菌劑，通過抑制病原菌有氧呼吸三羧酸循環(huán)中琥珀酸脫氫酶活性，干擾細胞分裂和生長，從而起到殺菌作用[6]。關于吡唑醚菌酯和啶酰菌胺的殘留檢測方法主要有氣相色譜法（GC）[7]、氣相色譜-質譜法（GC-MS）[8]、高效液相色譜法（HPLC）[9]和液相色譜-質譜法（LC-MS）[10]等。前處理方法有固相萃取[11]、液液萃取[12]、分散固相萃取[8]和QuECh-ERS[10]法。其中QuEChERS前處理方法結合LC-MS，靈敏度高，重復性好。關于吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在草莓[10]、葡萄[11]和黃瓜[13]中的殘留行為已有報道，但有關吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的檢測方法及殘留研究未見報道。

目前，我國規(guī)定吡唑醚菌酯在桃上的最大殘留限量（MRL）為1 mg/kg，未規(guī)定啶酰菌胺在桃上的MRL[14]，歐盟規(guī)定啶酰菌胺在桃上的MRL為5 mg/kg[15]。為評價吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃果上的殘留及消解水平，本研究建立UPLC-MS/MS快速檢測吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的殘留分析方法，并開展吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃上的消解動態(tài)研究，為其安全使用提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

ACQUITY UPLC-TQD超高效液相色譜-三重四極桿質譜聯用儀、ACQUITYUPLC BEHC18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），Waters公司；CK-2000高通量組織研磨儀，托摩根生物科技有限公司；TG16-WS臺式高速離心機，長沙湘儀離心機有限公司；Mili-Q超純水儀，美國Milipore公司。

吡唑醚菌酯標準品（純度98.6%），啶酰菌胺標準品（純度98.6%），北京勤誠亦信科技開發(fā)有限公司；乙腈（色譜純）、甲酸，北京北化精細化學品有限公司；N-丙基乙二胺（PSA）（40 μm）、Filter Unit濾膜（0.22 μm），天津博納艾杰爾科技有限公司；乙腈、無水硫酸鎂、氯化鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司；38%唑醚·啶酰菌水分散粒劑，巴斯夫（中國）有限公司。

1.2 田間試驗設計

參照NY/T788—2018《農作物中農藥殘留試驗準則》[16]，于2018年4—8月分別在北京市大興區(qū)、山西省晉中榆次區(qū)、河南省濟源市以及湖南省長沙市的桃園中進行38%唑醚·啶酰菌水分散粒劑在桃樹上的殘留消解動態(tài)試驗。設置空白對照區(qū)和消解動態(tài)區(qū)，每個小區(qū)有桃樹4株，每個處理重復3次，隨機排列，處理間設保護帶。在桃褐腐病發(fā)病初期，按推薦最高劑量有效成分用量253.3 mg/kg，制劑用量1 500倍液兌水莖葉噴霧1次。分別于施藥后7、14、21、28、35 d采集桃樣品，隨機取樣2 kg，縮分留樣200 g，勻漿后-20℃低溫冷凍保存待測。

1.3 分析方法

1.3.1 檢測條件

色譜條件：ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：30℃；流動相：0.1%甲酸水溶液、乙腈，流速：0.3 mL/min；進樣量：3 μL；梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件

質譜條件：電噴霧離子源，正離子電離模式（ESI＋）。毛細管電壓3.5 kV，離子源溫度150℃，去溶劑溫度500℃，去溶劑氣（N2）流量650 L/h，錐孔反吹氣（N2）流量50 L/h。采用多重反應監(jiān)測（MRM），具體參數見表1。

表2 多重反應監(jiān)測（MRM）質譜參數

1.3.2 樣品前處理

稱取10.0g（精確到0.01 g）均質桃樣品于含50 mL聚四氟乙烯的離心管中，加入5 mL超純水，渦旋3 min后加入10 mL乙腈，2 000次/min振蕩提取10 min，然后加1 g NaCl和4 g無水硫酸鎂，2 000次/min迅速振蕩5 min，再以4 000 r/min離心5 min后，移取1.5 mL上清液（乙腈層）至裝有50 mg PSA和150 mg無水硫酸鎂的2 mL離心管中，2 000 r/min渦旋1 min，5 000 r/min離心5 min后，上清液過0.22 μm有機濾膜，于-20℃貯存待測。

1.3.3 標準溶液配制及基質標準曲線繪制

用電子天平分別稱取0.010 14 g吡唑醚菌酯（98.6%）和啶酰菌胺（98.6%）標準品，用色譜純乙腈作溶劑配制100 mg/L儲備液100 mL，于4℃避光保存。

用色譜純乙腈梯度稀釋，配制質量濃度分別為2.00、1.00、0.50、0.20、0.10、0.05、0.02、0.01 mg/L的系列標準品混合溶液；用空白桃樣品提取液稀釋，配制上述質量濃度的混合基質標準溶液，分別以吡唑醚菌酯和啶酰菌胺的質量濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.3.4 添加回收試驗

分別添加3個水平的吡唑醚菌酯和啶酰菌胺混合標準溶液于空白桃均質樣品中，其添加水平分別為0.01、1.00、2.00 mg/kg。按1.3.1條件進行檢測，計算添加回收率及相對標準偏差。

1.3.5 數據處理

吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的殘留量隨時間變化，可用一級動力學方程表示。

式中：Ct為時間t時的農藥殘留量，mg/kg；C0為施藥后的原始沉積量，mg/kg；k為消解系數，d-1；t為施藥后時間，d。

通過式（1）得到的消解系數k，通過式（2）即可計算消解半衰期T1/2。

2 結果與分析

2.1 檢測條件優(yōu)化

為使吡唑醚菌酯、啶酰菌胺的測定達到最佳靈敏度和最佳分離效果，將0.1 mg/L吡唑醚菌酯和啶酰菌胺標準溶液在掃描范圍100～500m/z直接進樣，選擇合適的離子源。在電噴霧離子源、正離子模式下，吡唑醚菌酯和啶酰菌胺均具有較好的電離效果，并獲得特征離子峰［M＋H］。在此基礎上優(yōu)化監(jiān)測離子、錐孔電壓和碰撞能量等質譜參數，最終優(yōu)化條件如1.3.1所述。進一步優(yōu)化色譜條件，在流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液時，得到較好的靈敏度、重現性及峰形（圖1）。

2.2 方法的線性范圍、靈敏度

基質匹配外標法定量分析，結果表明吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在0.01～2 mg/L的質量濃度范圍內均呈現良好的線性關系。其回歸方程和相關系數分別是：y=2 798.5x＋156 696，R2=0.990 9（吡唑醚菌酯）；y=434.84x＋6 166.7，R2=0.999 2（啶酰菌胺）。在0.01、1.00、2.00 mg/kg添加水平下，吡唑醚菌酯在桃中的平均回收率為89.8～96.9%，相對標準偏差為0.8%～5.4%；啶酰菌胺在桃中的平均回收率為81.1%～100.5%，相對標準偏差為3.3%～8.9%（表3）。吡唑醚菌酯和啶酰菌胺的定量限均為0.01 mg/kg。

圖1 吡唑醚菌酯和啶酰菌胺標準品色譜圖（0.01 mg/L）

表3 吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的添加回收率及相對標準偏差（n=5）

2.3 吡唑醚菌酯、啶酰菌胺在桃中的消解動態(tài)

吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的消解動態(tài)均符合一級動力學方程回歸曲線Ct=C0e-kt，吡唑醚菌酯在北京、山西、河南、湖南等4個地區(qū)桃中的半衰期分別為15.8、7.8、13.1、7.2 d；啶酰菌胺在北京、山西、河南、湖南等4個地區(qū)桃中的半衰期分別為11.0、7.1、11.8、7.0 d，結果見表4。吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在不同地區(qū)的消解動態(tài)曲線見圖2，兩者均在山西和湖南消解較快，在北京和河南消解較慢。

表4 吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中消解動態(tài)

圖2 吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在不同地區(qū)的消解動態(tài)

3 結論與討論

本研究在QuEChERS方法基礎上，建立了UPLCMS/MS測定桃中吡唑醚菌酯和啶酰菌胺的殘留分析方法。在0.01～2.00 mg/L范圍內，吡唑醚菌酯和啶酰菌胺的濃度與色譜峰面積均呈現良好的線性關系；在添加水平為0.01～2.00 mg/kg時，吡唑醚菌酯在桃中的平均回收率為89.8%～96.9%，相對標準偏差為0.8%～5.4%；啶酰菌胺在桃中的平均回收率為81.1%～100.5%，相對標準偏差為3.3%～12.1%。吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃中的定量限均為0.01 mg/kg。與楊霄鴻等[10]建立的HPLC-MS/MS測定吡唑醚菌酯和啶酰菌胺殘留方法相比，本方法的定量限更低，靈敏度更高，且操作快速、簡便。

據報道，吡唑醚菌酯在草莓上的消解半衰期為4.8～6.0 d[10]，在辣椒上為5.1～7.0 d[17]，在花生上為10.3～11.2 d[18]；啶酰菌胺在草莓上的消解半衰期為5.1～11.0 d[10]，在黃瓜上為2.67～9.90 d[14]，在番茄上為7.6～11.7 d[19]。本研究結果表明，吡唑醚菌酯在桃上的消解半衰期為7.2～15.8 d；啶酰菌胺在桃上的消解半衰期為7.0～11.8 d。吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在不同作物的消解半衰期差異不大，均屬于易降解農藥。本研究提供了吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃上殘留分析方法及消解動態(tài)數據，為吡唑醚菌酯和啶酰菌胺在桃上的安全使用提供參考。