鐘裕健，鄭莉，孫水裕，許燕濱，杜青平，謝光炎，劉艷婷，蔡秋杰，謝志帆

(廣東工業(yè)大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006)

近30年來，我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)迅速發(fā)展。為了加快畜禽的生長(zhǎng)、增強(qiáng)畜禽的抗病能力，追求經(jīng)濟(jì)利益最大化，飼料中通常添加過量的銅、鋅、砷等微量元素，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過畜禽的吸收率[1]，并通過糞便和尿液的形式排出體外，導(dǎo)致糞便中重金屬含量過高[2]。畜禽糞便富含有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分，是傳統(tǒng)的有機(jī)肥料[3]，但這些畜禽糞便作為肥料用于農(nóng)田后會(huì)造成重金屬的積累，并可能對(duì)人體健康造成危害[4]。目前常規(guī)有效的解決方式有物理和化學(xué)方法兩種[5]，成本高且容易造成其他環(huán)境污染。隨著生物浸出方法的研究，由于其克服上述缺陷，運(yùn)行成本低、應(yīng)用范圍廣、操作簡(jiǎn)單和污染小的優(yōu)點(diǎn)引起了業(yè)內(nèi)外的廣泛研究和關(guān)注[6]。

生物浸出技術(shù)最早應(yīng)用于礦石中提取有用金屬[7-8]，根據(jù)這一原理應(yīng)用于污染物的重金屬去除，發(fā)展為生物浸出技術(shù)[9]?，F(xiàn)有的相關(guān)生物浸出方法多采用化能自養(yǎng)型細(xì)菌，或者是將自養(yǎng)和異養(yǎng)細(xì)菌混合培養(yǎng)投入使用。研究發(fā)現(xiàn)，部分異養(yǎng)菌在生物浸出時(shí)表現(xiàn)也較為優(yōu)異。黑曲霉(Aspergillusniger)是目前在生物浸出中常用的真菌。其在生長(zhǎng)代謝過程中產(chǎn)草酸、葡萄糖酸和檸檬酸等有機(jī)酸[10-12]，通常應(yīng)用于污染土壤中浸出重金屬，并取得較好的效果。目前黑曲霉生物浸出主要應(yīng)用于低品位礦石或尾礦[13-15]、城市燃燒垃圾飛灰[11，16-17]、赤泥[18-19]、廢棄電路板[20-22]，但對(duì)畜禽糞便的生物浸出報(bào)道比較少，尤其是黑曲霉間接生物浸出的研究。

本文選用黑曲霉作為畜禽糞便進(jìn)行間接生物浸出，重點(diǎn)研究黑曲霉產(chǎn)有機(jī)酸的優(yōu)化，生物浸出去除畜禽糞便重金屬的效果以及浸出過程中重金屬形態(tài)的變化。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

蔗糖、酵母浸膏、瓊脂、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鉀、硫酸鐵、磷酸、過氧化氫、鹽酸、硝酸、氯化鎂、醋酸、醋酸鈉、醋酸銨、鹽酸羥胺均為化學(xué)純；雞糞，取自廣州市番禺某養(yǎng)雞場(chǎng)(烘干，研磨過60目篩網(wǎng))，基本性質(zhì)分析見表1。

表1 雞糞的基本理化性質(zhì)

AUY220型電子分析天平；SHA-B型恒溫振蕩器；Sorvall Legend T型高速離心機(jī)；ZSD-A1090A型生化培養(yǎng)箱；OPTEC型光學(xué)顯微鏡；無菌操作臺(tái)；LDZM-40KCS型高壓蒸汽滅菌鍋；PHS-25型pH計(jì)；Bio-rad S1000TM Thermal Cycler PCR儀；TSQ Endura三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀；Z-2000型原子吸收光譜；AF-640A型原子熒光光譜。

1.2 菌種培養(yǎng)[23]

雞糞在錐形瓶富集培養(yǎng)后，再涂布查氏固體培養(yǎng)基。利用溴甲酚綠的查氏篩選平板連續(xù)劃線純化得到數(shù)株菌。將相同濃度的不同菌種的孢子，分別接種在滅菌的蔗糖培養(yǎng)基(100 g蔗糖，1.6 g酵母浸膏，1.5 g NaNO3，0.5 g K2HPO4，0.025 g MgSO4·7H2O，0.025 g KCl，1 L去離子水)[24]，于30 ℃、120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)6 d，選取培養(yǎng)基pH最低的菌種樣本進(jìn)行鑒定。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn) 將黑曲霉在蔗糖平板上培養(yǎng)7 d，用無菌棉簽刮下孢子，在裝有無菌水的錐形瓶中洗下孢子，振蕩搖勻，配制成黑曲霉孢子懸浮液，在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算濃度，經(jīng)過進(jìn)一步的稀釋后，孢子濃度約為1.0×107個(gè)/mL。在無菌蔗糖培養(yǎng)基中接入20 mL/L的孢子懸浮液，于30 ℃、120 r/min條件下進(jìn)行純培養(yǎng)，每2 d取培養(yǎng)液進(jìn)行有機(jī)酸的測(cè)定。

1.3.2 間接生物浸出實(shí)驗(yàn) 在黑曲霉產(chǎn)酸優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)中，選擇產(chǎn)酸量最大的一組進(jìn)行生物浸出實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)液經(jīng)過濾紙過濾得到無細(xì)胞培養(yǎng)濾液，用于雞糞的浸出[25]。在錐形瓶中裝入100 mL的培養(yǎng)濾液，加入40 g/L的雞糞樣品，瓶口蓋上棉紗。置于30 ℃，180 r/min的恒溫振蕩器內(nèi)進(jìn)行浸出實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)器皿都經(jīng)過滅菌處理。每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行樣。浸出過程中，每4 h取上清液，測(cè)定其中的重金屬濃度(Cu、Zn和As)。

通過Tessier五步法[25]測(cè)定浸出過程中雞糞重金屬的形態(tài)變化。提取步驟見表2。準(zhǔn)確稱取1 g(精確到0.000 1 g)雞糞樣品，每個(gè)形態(tài)提取完后，進(jìn)行15 000 r/min離心15 min，保留沉淀的樣品，上層清液用于測(cè)定重金屬含量。沉淀樣品用去離子水洗滌2次后，離心，棄去上層清液，然后進(jìn)行下一個(gè)形態(tài)的提取。

表2 Tessier五步提取法Table 2 Tessier’s five step of extraction procedure

1.4 分析方法

雞糞用微波消解儀消解，重金屬含量用火焰原子吸收光譜儀和原子熒光光譜進(jìn)行測(cè)定[26]，有機(jī)質(zhì)含量用燃燒法進(jìn)行測(cè)定，有機(jī)酸含量用三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用儀測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株鑒定

2.1.1 形態(tài)學(xué)鑒定 觀察菌種樣本培養(yǎng)在蔗糖平板中的菌落狀態(tài)，用顯微鏡觀察孢子的形態(tài)結(jié)構(gòu)等。結(jié)果見圖1。

圖1 黑曲霉在平板(a)和顯微鏡下(b)的形態(tài)特征Fig.1 Morphological photographs of Aspergillus niger on PDA medium (a) and microscope (b)

由圖1可知，菌株在蔗糖培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d，出現(xiàn)圓形的菌落，表面為毛絨狀的突起；培養(yǎng)初期為黃白色的菌絲，后生長(zhǎng)成黑褐色的孢子。根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》，初步判斷篩選所得菌株為黑曲霉(Aspergillusniger)[23]。

2.1.2 分子生物學(xué)鑒定 采用真菌DNA試劑盒提取菌種樣本的DNA，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增18S rDNA-ITS序列，對(duì)序列雙向測(cè)序與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)庫(kù)序列比較，發(fā)現(xiàn)18S rDNA-ITS序列和Aspergillusniger相近，同源度僅存在1%的差異性。將序列提交到NCBI后，該黑曲霉菌株的登錄序列號(hào)為MH978907。采用MEGA 5.0軟件構(gòu)建該菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。結(jié)合形態(tài)觀察和培養(yǎng)特性的初步鑒定，確認(rèn)篩選所得菌株為黑曲霉(Aspergillusniger)[27]。

圖2 黑曲霉菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.2 產(chǎn)酸條件優(yōu)化

2.2.1 產(chǎn)酸特性 黑曲霉在生長(zhǎng)代謝過程中，將簡(jiǎn)單高分子碳水化合物如蔗糖轉(zhuǎn)化為檸檬酸、葡萄糖酸、草酸等低分子有機(jī)酸，導(dǎo)致體系的pH逐漸下降，從初始的5.7下降到1.5。

由圖3可知，培養(yǎng)6 d，葡萄糖酸產(chǎn)量達(dá)到最高(17.50 mmol/L)，后期基本趨穩(wěn)，略有下降，維持在10 mmol/L左右；草酸的產(chǎn)量迅速增加，第4 d達(dá)到14.28 mmol/L，隨后逐漸降低，在15 d降低至2.60 mmol/L。檸檬酸的濃度則隨著培養(yǎng)時(shí)間上升。有研究指出，體系中的pH對(duì)黑曲霉分泌葡萄糖酸有很大影響，在pH 4.5～6.5時(shí)葡萄糖氧化酶的活性最大，葡萄糖酸的產(chǎn)量也最多，在pH<3.0時(shí)氧化酶的活性受到抑制，從而導(dǎo)致葡萄糖酸的產(chǎn)量速率下降[28]；而培養(yǎng)4 d后，草酸可能參與檸檬酸的代謝循環(huán)被分解，導(dǎo)致草酸的濃度下降，檸檬酸的濃度持續(xù)上升[23]?？傮w上看，培養(yǎng)15 d時(shí)檸檬酸的產(chǎn)量最高(71.34 mmol/L)，而葡萄糖酸(10.47 mmol/L)處在較穩(wěn)定水平，草酸(2.60 mmol/L)有所下降，培養(yǎng)液的pH接近 1.5，這一酸性環(huán)境有利于將畜禽糞便的重金屬浸出。崔雨琪[23]曾報(bào)道黑曲霉純培養(yǎng)20 d產(chǎn)酸分別為：檸檬酸約55 mmol/L，葡萄糖酸約20 mmol/L，草酸約16 mmol/L。由于檸檬酸的產(chǎn)量遠(yuǎn)大于其他兩種有機(jī)酸，且檸檬酸對(duì)重金屬浸出起主要作用，因此，設(shè)計(jì)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化檸檬酸的產(chǎn)量。

圖3 黑曲霉產(chǎn)酸趨勢(shì)圖

2.2.2 正交實(shí)驗(yàn) 以蔗糖濃度、接種量和培養(yǎng)溫度3個(gè)因素設(shè)計(jì)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)，確定產(chǎn)酸的最優(yōu)條件，因素與水平見表3。每種實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果見表4。

表3 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表4 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Result of orthogonal experiment

由表4可知，3種因素對(duì)檸檬酸的產(chǎn)量的影響由大到小依次為培養(yǎng)溫度(C)、接種量(B)、蔗糖濃度(A)。其最優(yōu)方案是A2B2C2，即培養(yǎng)基的蔗糖濃度為100 g/L、接種量為40 ml/L、培養(yǎng)溫度為30 ℃。

對(duì)最優(yōu)方案進(jìn)行驗(yàn)評(píng)實(shí)驗(yàn)，平行3次，結(jié)果檸檬酸產(chǎn)量為71.23 mmol/L，因此，上述條件最適合黑曲霉產(chǎn)檸檬酸。

2.3 重金屬浸出率

圖4為雞糞中各重金屬去除過程的動(dòng)態(tài)變化情況。

圖4 間接生物浸出雞糞的重金屬浸出動(dòng)態(tài)Fig.4 Trends in metal removal of chicken manure by indirect bioleaching

由圖4可知，含有大量有機(jī)酸的培養(yǎng)濾液對(duì)雞糞重金屬浸出有不錯(cuò)的效果。間接浸出主要的作用機(jī)理是酸解。酸化(質(zhì)子流出)有利于金屬遷移，而且是真菌浸出過程中最重要的機(jī)制，因?yàn)橘|(zhì)子與金屬陰離子中的金屬之間的競(jìng)爭(zhēng)或被吸收的形式，游離的金屬陽(yáng)離子釋放到浸出液中，可導(dǎo)致固廢中金屬的遷移。酸解在浸出過程中的作用取決于培養(yǎng)濾液的pH。酸解和絡(luò)合分解分別在強(qiáng)酸性和弱酸性條件下起作用。在酸解過程中，氫離子的濃度在堿性階段下降，在堿性階段，絡(luò)合分解占據(jù)并控制了大部分金屬的溶解[29]。浸出過程中，pH變化不大，從3.6升高到4.1。浸出4 h，Cu、Zn、As浸出率分別為55.35%，69.06%，34.53%。隨著浸出時(shí)間加長(zhǎng)，最終20 h的Cu、Zn、As浸出率分別為63.93%，79.22%，42.55%。Zn的浸出效果最佳，Cu次之。檸檬酸和葡萄糖酸是生物浸出中Cu和Zn的主要和有效的浸出劑[30]。Qu[18]曾報(bào)道間接浸出2%濃度的紅泥，20 d后浸出率分別為Cu約50%，Zn約80%，As約40%。雖然本實(shí)驗(yàn)的浸出率比報(bào)道略有偏低，但是浸出時(shí)間縮短10 d。

根據(jù)《土壤環(huán)境質(zhì)量農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)管控標(biāo)準(zhǔn)(試行)(GB 15618—2018)》[31]的農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)篩選值規(guī)定，Cu、Zn、As的最低含量在50，200，20 mg/kg以下。由表5可知，經(jīng)過生物浸出后，Cu、Zn和 As達(dá)到土壤環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)，這說明生物浸出可以實(shí)現(xiàn)雞糞重金屬的減量化，雞糞作為有機(jī)肥料用于農(nóng)業(yè)施肥。

表5 農(nóng)用地土壤污染風(fēng)險(xiǎn)篩選值和雞糞重金屬含量Table 5 Farmland soil pollution risk control standard and heavy metal content of chicken manure (mg/kg)

2.4 浸出過程中重金屬形態(tài)變化

金屬形態(tài)的分布代表雞糞中重金屬的穩(wěn)定性和生物有效性，也代表生物浸出的效率。根據(jù)Tessier[26]分類重金屬形態(tài)有5種，而且具有不同的能量狀態(tài)?？山粨Q態(tài)、碳酸鹽結(jié)合態(tài)、鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)，這3種的穩(wěn)定性更差，有較高的風(fēng)險(xiǎn)性和生物可利用性。有機(jī)物結(jié)合態(tài)和硫化物結(jié)合態(tài)、殘留態(tài)相對(duì)比較穩(wěn)定，更難被生物利用[25]。

對(duì)生物浸出不同階段的雞糞樣品進(jìn)行重金屬提取的結(jié)果見圖5。

圖5 生物浸出過程中Cu、Zn、As的重金屬形態(tài)變化Fig.5 The variation of Cu，Zn and Asspeciation during the bioleaching

由圖5可知，生物浸出對(duì)殘留物中金屬的形態(tài)有明顯的變化。對(duì)于原始樣品而言，Cu的重金屬形態(tài)主要集中在有機(jī)物結(jié)合態(tài)和硫化物結(jié)合態(tài)(84.83%)。浸出20 h后，占比從84.83%減少至33.77%，其他重金屬形態(tài)的比例僅有微量的減少。對(duì)于Zn，重金屬形態(tài)大部分為鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)(56.91%)、有機(jī)物結(jié)合態(tài)和硫化物結(jié)合態(tài)(27.56%)。浸出20 h后，鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)下降到13.64%，而有機(jī)結(jié)合態(tài)和硫化物結(jié)合態(tài)則是下降到5.11%。前12 h，殘留態(tài)的比例隨時(shí)間下降，后8 h卻略微上升，推測(cè)是鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)的溶解導(dǎo)致殘留態(tài)的增加。生物浸出對(duì)各形態(tài)的As均有減少，鐵錳氧化物結(jié)合態(tài)減少19.34%，殘留態(tài)減少9.12%，其他3種形態(tài)平均減少6%?？紤]到原雞糞中5種形態(tài)的占比，4種形態(tài)的As降低幅度接近(5%～8%)，而殘留形態(tài)的降低幅度最少(2%)。表明殘留態(tài)的As比較穩(wěn)定，不易被浸出。

經(jīng)過黑曲霉培養(yǎng)濾液的浸出后，雞糞的生物有效性大大降低(表6)。根據(jù)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)準(zhǔn)則 (RAC)[32]，以生物有效性較高的重金屬形態(tài)所占的比例W將風(fēng)險(xiǎn)程度分為以下5種：無(W<1%)、低(1% ≤W≤10%)、中等(11% ≤W≤30%)、高(31% ≤W≤50%)、非常高(W>50%)。經(jīng)過20 h的浸出之后，Cu和As的生物有效性很低(約為2%和9.71%)，RAC等級(jí)劃分為低，這說明浸出后Cu和As的可生物利用性低，對(duì)環(huán)境構(gòu)成的風(fēng)險(xiǎn)較低；而Zn對(duì)環(huán)境構(gòu)成的風(fēng)險(xiǎn)從非常高(64.05%)，降低到中等(14.72%)，這說明生物浸出大大降低了Zn的生物利用性。只需經(jīng)過再一步的無害化處理，雞糞對(duì)環(huán)境構(gòu)成的風(fēng)險(xiǎn)更低。

表6 雞糞經(jīng)生物浸出后的生物有效性Table 6 Bioavailability of chicken manure after bioleaching

3 結(jié)論

(1)從雞糞中分離得到產(chǎn)酸黑曲霉，黑曲霉生長(zhǎng)代謝過程中分泌葡萄糖酸、檸檬酸和草酸，檸檬酸的產(chǎn)量遠(yuǎn)超過其他有機(jī)酸。在優(yōu)化條件蔗糖濃度100 g/L、接種量40 mL/L、溫度30 ℃下檸檬酸最大產(chǎn)量約為71.23 mmol/L。

(2)經(jīng)過20 h的間接生物浸出后，重金屬Zn浸出率最高，為79.22%，Cu和As浸出率分別為63.93%，42.55%，達(dá)到新實(shí)施的土壤環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

(3)生物浸出對(duì)雞糞中3種重金屬的形態(tài)有明顯的影響。生物浸出后，雞糞的生物可利用性有不同程度的降低，對(duì)環(huán)境構(gòu)成的風(fēng)險(xiǎn)大大降低。