張藝萍,楊秀梅,許 鳳,王麗花,蘇 艷,唐藝蓉,瞿素萍*,吳學尉

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院 花卉研究所/國家觀賞園藝工程技術(shù)研究中心/云南省花卉育種重點實驗室/云南省花卉工程技術(shù)研究中心/云南省昆明市花卉遺傳改良重點實驗室,云南 昆明 650205;2.云南云科花卉有限公司,云南 昆明 650200;3.云南大學 農(nóng)學院,云南 昆明 650200)

寄主植物在受到病原菌侵染以后會發(fā)生一系列的生理生化變化,其中POD (peroxidase) (過氧化物酶)、PPO (polyphenol oxidase) (多酚氧化酶)、PAL (phenylalanine ammonia-lyase) (苯丙氨酸解氨酶)、β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶是跟寄主植物抗病性緊密相關(guān)的酶類。寄主植物在抵抗病原菌的侵染過程中,抗病性相關(guān)酶起到十分重要的作用,這主要包括酚類代謝系統(tǒng)中的一些酶和病原相關(guān)蛋白家族。POD在寄主植物抗病反應(yīng)中所起的關(guān)鍵作用主要表現(xiàn)在以下幾個方面:(1)POD參與木質(zhì)素的合成[1];有學者研究發(fā)現(xiàn)水稻在遭受黃單胞病菌侵染后,陽離子過氧化物酶可以在水稻葉肉細胞壁、細胞間隙及木質(zhì)部導(dǎo)管腔內(nèi)累積,致使水稻黃單胞病菌無法侵染到寄主細胞內(nèi),因此認為這種陽離子POD參與木質(zhì)素的合成與寄主植物的抗病性相關(guān)[2]。(2) POD可將寄主植物細胞內(nèi)的酚類物質(zhì)氧化成醌類物質(zhì),從而增強寄主植物的抗病性;有學者研究了洋蔥與蔥腐葡萄孢的互作后發(fā)現(xiàn),在蔥腐葡萄孢侵入洋蔥表皮細胞的部位,酚類物質(zhì)含量明顯增多并形成顆粒沉積物,顆粒沉積物的形成與過氧化物酶的活性增強緊密相關(guān)[3]。(3) POD參與木栓質(zhì)的合成,從而可以加快寄主植物傷口愈合的速度;有研究發(fā)現(xiàn)在番茄組織和馬鈴薯塊莖的過敏性反應(yīng)中陰離子過氧化物酶催化合成木栓質(zhì)[4]。(4) POD參與富含羥脯氨酸糖蛋白的合成,從而增強寄主細胞表面的強度[5]。

PAL參與苯丙烷類代謝通路上的第一步反應(yīng),它參與植保素、黃酮、酚類物質(zhì)及木質(zhì)素等抗菌物質(zhì)的合成, PAL與寄主植物的抗病性緊密相關(guān)[6]。有學者研究了枯萎病尖孢鐮刀菌侵入西瓜幼苗后其葉片和根莖部組織中POD和PAL的活性變化,發(fā)現(xiàn)隨著病原菌的侵入,抗病西瓜品種和感病西瓜品種體內(nèi)POD和PAL兩種酶的活性都有不同程度的增強,但抗病西瓜品種的增強幅度比感病西瓜品種顯著提高[7,8]。李捷等[9]研究發(fā)現(xiàn)接種枸杞根腐病菌尖孢鐮刀菌后,抗病的枸杞品種中PAL活性明顯比感病品種的強。周瑜等[10]研究發(fā)現(xiàn)接種糜子黑穗病菌后,感病品種糜子葉片中PAL活性變化幅度明顯大于抗病品種。王紹敏等[11]研究發(fā)現(xiàn)接種立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)后72 h內(nèi),玉米體內(nèi)的PAL活性呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢,并在72 h時出現(xiàn)第一個峰值；隨后PAL活性降低,在144 h時又呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢。

高等植物體內(nèi)PPO是由核編碼的含銅的金屬蛋白酶,位于植物細胞質(zhì)體內(nèi)囊體,PPO的底物位于細胞液泡內(nèi),當病原菌侵入寄主植物時,PPO與底物結(jié)合,氧化底物合成醌類物質(zhì),多酚及醌類物質(zhì)能使病原菌生長所必需的磷酸化酶和轉(zhuǎn)氨酶的合成受到阻礙,從而限制病原菌的進一步擴展。PPO不但可以參與酚類物質(zhì)的氧化,還可以參與木質(zhì)素的合成,木質(zhì)素除了可以增強寄主植物細胞壁對抗病原菌的壓力外,還能抑制真菌酶和病原菌所分泌的毒素的進一步擴散,進而可以限制病原菌的侵入。PPO氧化酶活性與抗病性相關(guān)[12]。研究發(fā)現(xiàn)PPO活性與玉米抗感病害的研究結(jié)果吻合[13]。

本研究主要測定了百合抗病無性系和感病無性系在接種尖孢鐮刀菌和尖孢鐮刀菌毒素后POD、PAL、PPO、β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶的活性變化，這將有利于揭示毒素篩選無性系的生化抗性機制,從而為該方法提供一定的生化理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料 采用正常生長的感病百合品種‘卡薩布蘭卡’(‘Casa Blanca’)無性系(以下簡稱感病無性系),以及經(jīng)尖孢鐮刀菌百合?；投舅睾Y選后獲得的‘卡薩布蘭卡’抗病無性系(以下簡稱抗病無性系)作為實驗材料。

1.1.2 病原菌 從感病組織中分離純化后獲得的尖孢鐮刀菌百合專化型(F.oxysporumf. sp.lilii),已經(jīng)經(jīng)過菌絲、孢子形態(tài)及分子鑒定。其菌株一直保存在PDA培養(yǎng)基上。

1.2 實驗方法

1.2.1 尖孢鐮刀菌孢子懸浮液及其粗毒素的制備 將馬鈴薯蔗糖瓊膠(PSA)培養(yǎng)基上的尖孢鐮刀菌擴大培養(yǎng)后配制成孢子懸浮液(含孢子1×106個/mL)。無菌尖孢鐮刀菌毒素粗提液的制備參照臺蓮梅等[14]的方法進行。

1.2.2 樣品處理及制備方法 將感病無性系和抗病無性系的生根組培苗置于含無菌水的試管中,切根后接種尖孢鐮刀菌百合?；偷逆咦討腋∫?孢子1×106個/mL)；同時取切根后的植株浸于粗毒素中。分別于接種后0、6、12、24、48、72 h取樣,在紫外分光光度計上測定POD、PAL、PPO、β-1,3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶的活性。

1.2.3 防御酶活性的測定方法 POD、PAL活性的測定按李合生[15]的方法進行。PPO活性的測定按梁小紅[16]的方法進行。β-1,3-葡聚糖酶的提取和活性測定參照余永廷等[17]的方法進行。幾丁質(zhì)酶的提取和活性測定參照史益敏[18]的方法進行。酶活性是以實驗材料的干重DW(g)為單位進行計算的。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計分析 采用Excel 2007軟件統(tǒng)計與整理實驗數(shù)據(jù),并用插圖功能生成圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗病無性系和感病無性系POD活性的變化

如圖1所示,經(jīng)百合尖孢鐮刀菌及其毒素誘導(dǎo)后,抗病無性系和感病無性系的POD活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢,但抗病無性系的POD活性高于感病無性系,抗病無性系的POD活性在48 h達最高；抗病無性系經(jīng)百合尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)后,POD活性峰值比感病無性系提高了322.03 U/(g·min)；抗病無性系經(jīng)毒素誘導(dǎo)后,POD活性峰值比感病無性系提高了244.33 U/(g·min)。

圖1 抗病無性系和感病無性系POD活性的變化

2.2 抗病無性系和感病無性系PAL活性的變化

如圖2所示,經(jīng)百合尖孢鐮刀菌及其毒素誘導(dǎo)后,百合抗病無性系和感病無性系的PAL活性均呈現(xiàn)出先升高后降低的變化趨勢?？共o性系的PAL活性均較感病無性系有所提高,抗病無性系的PAL活性在48 h達最高；抗病無性系經(jīng)尖孢鐮刀菌處理后,PAL活性峰值比感病無性系提高了93.34 U/(g·min)；抗病無性系經(jīng)毒素誘導(dǎo)后,PAL活性峰值比感病無性系提高了203.33 U/(g·min)。

圖2 抗病無性系和感病無性系PAL活性的變化

2.3 抗病無性系和感病無性系PPO活性的變化

如圖3所示,經(jīng)百合尖孢鐮刀菌及其毒素誘導(dǎo)后,抗病無性系和感病無性系的PPO活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢。抗病無性系的PPO活性均比感病無性系的高,抗病無性系的PPO活性在48 h達最高；抗病無性系經(jīng)百合尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)后,PPO活性峰值比感病無性系提高了64.00 U/(g·min)；抗病無性系經(jīng)毒素誘導(dǎo)后,PPO活性峰值比感病無性系提高了53.20 U/(g·min)。

2.4 抗病無性系和感病無性系β-1,3-葡聚糖酶活性的變化

如圖4所示,經(jīng)百合尖孢鐮刀菌及其毒素誘導(dǎo)后,抗病無性系和感病無性系的β-1,3-葡聚糖酶活性均呈現(xiàn)逐漸升高的變化趨勢?？共o性系的β-1,3-葡聚糖酶活性急劇上升,在72 h時達最高；抗病無性系經(jīng)百合尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)后,其β-1,3-葡聚糖酶活性峰值比感病無性系提高了142.00 U/(g·min)；抗病無性系經(jīng)毒素誘導(dǎo)后,其β-1,3-葡聚糖酶活性峰值比感病無性系提高了107.00 U/(g·min)。

2.5 抗病無性系和感病無性系幾丁質(zhì)酶活性的變化

如圖5所示,經(jīng)百合尖孢鐮刀菌及其毒素誘導(dǎo)后,抗病無性系和感病無性系的幾丁質(zhì)酶活性均呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢?？共o性系的幾丁質(zhì)酶活性比感病無性系有所提高,但峰值提高不明顯。

圖3 抗病無性系和感病無性系PPO活性的變化

圖4 抗病無性系和感病無性系β-1,3-葡聚糖酶活性的變化

圖5 抗病無性系和感病無性系幾丁質(zhì)酶活性的變化

3 結(jié)論與討論

寄主植物的抗病性是建立在一系列物質(zhì)代謝的基礎(chǔ)之上的,其中催化這些物質(zhì)代謝反應(yīng)的酶是關(guān)鍵。PAL是植物莽草酸通路的關(guān)鍵酶和限速酶,在木質(zhì)素的積累、植保素和酚類物質(zhì)的合成中起十分關(guān)鍵的作用。POD是木質(zhì)素合成的關(guān)鍵酶之一,在阻止活性氧的形成、清除活性氧等方面起著十分重要的作用,POD活性可間接反映寄主植物體內(nèi)的活性氧代謝情況[19]。PPO能將寄主植物體內(nèi)的酚類物質(zhì)氧化成對病原菌有毒害作用的醌類物質(zhì)[20]。本實驗結(jié)果表明,在接種尖孢鐮刀菌和用尖孢鐮刀菌毒素誘導(dǎo)后,百合抗病無性系的POD、PAL和PPO活性均呈先上升后降低的趨勢。

病程相關(guān)蛋白(PR蛋白)的累積是寄主植物獲得系統(tǒng)抗病性的重要因子,β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶是寄主植物中重要的病程相關(guān)蛋白(PR蛋白)。寄主植物中的幾丁質(zhì)酶是其體內(nèi)與抗病性緊密相關(guān)的一種酶，它能將病原真菌的菌絲細胞壁中的幾丁質(zhì)進行酶解,導(dǎo)致原生質(zhì)膜破裂,從而破壞病原菌菌絲,抑制病原菌的菌絲生長,破壞細胞內(nèi)新物質(zhì)的累積,最終導(dǎo)致病原真菌死亡。此外,酶解后產(chǎn)生的病原真菌細胞壁降解物還能發(fā)揮誘導(dǎo)物的作用,激活寄主植物的抗病性反應(yīng)。本實驗結(jié)果表明,在接種尖孢鐮刀菌和用尖孢鐮刀菌毒素誘導(dǎo)后,百合抗病無性系的幾丁質(zhì)酶活性呈現(xiàn)出先上升后降低的趨勢。

β-1,3-葡聚糖酶參與代謝合成的產(chǎn)物可以作為誘導(dǎo)物誘導(dǎo)與其他抗病反應(yīng)有關(guān)的酶系,這些酶類可以促進木質(zhì)素、植保素等抗病物質(zhì)的合成與累積,從而加強寄主植物的抗病性[21]。本實驗中百合抗病無性系在接種尖孢鐮刀菌和經(jīng)尖孢鐮刀菌毒素誘導(dǎo)后，其體內(nèi)β-1,3-葡聚糖酶的活性增強,表明尖孢鐮刀菌毒素可能誘導(dǎo)了寄主植物的抗病性,且可能與植物的系統(tǒng)獲得抗病性有關(guān)系。但在本研究中β-1,3-葡聚糖酶的活性呈現(xiàn)一直上升的狀態(tài)并未形成山峰狀,這可能是因為誘導(dǎo)處理時間短。