王紫薇，涂明鋒，葉文峰*， 彭 靖

(1.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西 宜春 336000；2.宜春市人民醫(yī)院Ⅰ期臨床研究室，江西 宜春 336000)

淡竹葉為禾本科植物淡竹葉(Lophatherum gracile Brongn)的干燥莖葉，含有三萜類、黃酮類、酚性成分、多糖類等化合物，其中以黃酮類為主，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，淡竹葉具有抑菌、抗氧化、抗病毒、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤、解熱利尿、調(diào)節(jié)血糖等作用[1-5]。淡竹葉在臨床上應(yīng)用較為廣泛，已開(kāi)發(fā)成像小兒退熱口服液、口炎片、復(fù)方西羚解毒丸等制劑，淡竹葉所含有的黃酮類等化合物，在具有抗氧化、延緩衰老等功效的保健食品開(kāi)發(fā)上也有著十分巨大的應(yīng)用前景[6]。

實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助提取淡竹葉中黃酮類化合物，通過(guò)響應(yīng)面軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)選取的乙醇濃度、提取時(shí)間、超聲功率等主要影響因素單一作用及交互作用進(jìn)行更深入的研究，從而得出最佳提取工藝條件，并對(duì)淡竹葉黃酮的抗氧化性能進(jìn)行研究，為淡竹葉的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)[7-8]。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

淡竹葉(購(gòu)于宜春市神農(nóng)堂大藥房)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(上海源葉生物科技有限公司)，亞硝酸鈉、硝酸鋁(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)、無(wú)水乙醇、95%乙醇、30%H2O2、FeSO4、水楊酸、Tris-Hcl緩沖液、鄰苯三酚(均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，DPPH(阿拉丁試劑有限公司)，以上試劑均為分析純。

BS223S天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；752N紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海佑科儀器有限公司)；SK8210LHC超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 黃酮含量測(cè)定

采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測(cè)定黃酮含量，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，參照文獻(xiàn)[9-10]，并稍作修改。在510nm處測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=0.0095X-0.0317，R2=0.9964。然后測(cè)定黃酮提取液的吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程得到待測(cè)液中樣品濃度，再根據(jù)提取率公式求出淡竹葉黃酮的提取率，提取率公式如下：

式中:C為黃酮濃度,mg/mL;V為樣品溶液體積,mL;N為稀釋倍數(shù);m為淡竹葉粉末質(zhì)量,g。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

以黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探究乙醇濃度(45%、55%、65%、75%、85%)、提取時(shí)間(5min、15min、25min、35min、45min)、超聲功率(200W、250W、300W、350W、400W)對(duì)淡竹葉中黃酮提取率的影響。

2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

依據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)黃酮提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2.4 淡竹葉黃酮抗氧化性研究

2.4.1 淡竹葉黃酮對(duì)超氧陰離子的清除作用[11]

配制不同濃度的淡竹葉黃酮溶液，取1.0mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液于比色管中，分別加入4mL Tris-Hcl緩沖液，25℃水浴加熱20min，分別加入0.3mL 5 mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻，于420nm處檢測(cè)各組吸光值，空白對(duì)照組用相同體積的蒸餾水替代樣品，按如下公式進(jìn)行計(jì)算：

式中：A0為空白對(duì)照組吸光度；Ax為樣品組吸光度。

2.4.2 淡竹葉黃酮對(duì)羥自由基的清除作用[12]

取1.0mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液于比色管中，分別加入3mL 7.5mmol/L水楊酸-乙醇溶液、3mL磷酸鹽緩沖液(pH值=7.4)、2mL 0.75mmol/L FeSO4以及2mL 0.01%雙氧水，混勻，37℃水浴30min，于510nm處測(cè)吸光值。計(jì)算公式如下：

2.4.3 淡竹葉黃酮對(duì)DPPH的清除作用[13]

取1.0mL不同質(zhì)量濃度的樣品溶液于比色管中，分別加入4mL 0.1mmol/LDPPH溶液，混勻，放置在暗處反應(yīng)30min，于517nm處測(cè)定吸光度值。計(jì)算公式如下：

式中：Ax為不同樣品溶液吸光度值；Axo為1mL樣品+4mL乙醇吸光度值；Ao為1mL乙醇+4mLDPPH吸光度值。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

3.1.1 乙醇濃度對(duì)淡竹葉黃酮提取率的影響

乙醇濃度對(duì)淡竹葉黃酮提取率的影響結(jié)果如圖1所示。

圖1 乙醇濃度對(duì)黃酮提取率的影響

由圖1可看出，不同濃度的乙醇溶液作溶劑，黃酮提取率有所不同，乙醇濃度<65%時(shí)，黃酮提取率隨著乙醇濃度的增大而升高，乙醇濃度>65%時(shí)，黃酮提取率隨著乙醇濃度的增大而降低，由此可以確定乙醇的最佳濃度為65%。

3.1.2 提取時(shí)間對(duì)淡竹葉黃酮提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)淡竹葉黃酮提取率的影響結(jié)果如圖2所示。

圖2 提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率的影響

由圖2可看出，所用的提取時(shí)間不同，竹葉黃酮的提取率也有所不同，當(dāng)提取時(shí)間處于5～25min區(qū)間時(shí)，黃酮提取率隨著提取時(shí)間的增加而升高；當(dāng)提取時(shí)間處于25～45區(qū)間時(shí)，黃酮提取率隨著提取時(shí)間的增加而降低，表明25min應(yīng)為最佳提取時(shí)間。

3.1.3 超聲功率對(duì)淡竹葉黃酮提取率的影響

超聲功率對(duì)淡竹葉黃酮提取率的影響結(jié)果如圖3所示。

圖3 超聲功率對(duì)黃酮提取率的影響

由圖3可看出，超聲功率不同，淡竹葉黃酮提取率也有所不同，當(dāng)提取功率處于200～300W區(qū)間時(shí)，黃酮提取率隨著提取功率的增大而升高；當(dāng)提取功率處于300～400W區(qū)間時(shí)，黃酮提取率隨著提取功率的增大而降低，表明300W為最佳超聲功率。

3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

3.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)2.3設(shè)計(jì)的因素水平，采用Box-Beknhen實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，并對(duì)每組方案進(jìn)行試驗(yàn)，得出相應(yīng)的黃酮提取率，設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2。

表2 響應(yīng)面法設(shè)計(jì)與試驗(yàn)結(jié)果

表2(續(xù))

3.2.2 建立模型方程與顯著性檢驗(yàn)

根據(jù)表2中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)擬合回歸分析，得到淡竹葉黃酮提取率(Y)對(duì)乙醇濃度(A)、提取時(shí)間(B)、超聲功率(C)的二次多項(xiàng)回歸模型方程：

Y=2.09+0.07A+0.089B+0.036C-0.085AB-0.02AC-0.058BC-0.08A2-0. 14B2-0.093C2

表3 響應(yīng)面二次回歸方程方差及顯著性分析

注：*表示P<0.05，顯著差異；**表示P<0.01，極顯著差異；-表示P>0.05，差異不顯著。

二次多項(xiàng)回歸方程方差及顯著性分析見(jiàn)表3，該模型的P<0.0001，表明二次多項(xiàng)式模型整體上比較顯著，失擬項(xiàng)檢驗(yàn)的P=0.1248>0.05，表明失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著，方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9607，可知該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合較好，可以對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。一次項(xiàng)A、B、AB和BC的交互項(xiàng)及A2、B2和C2二次項(xiàng)對(duì)黃酮提取率均具有極顯著差異；一次項(xiàng)C對(duì)黃酮提取率具有顯著差異；AC交互項(xiàng)對(duì)黃酮提取率不具有顯著性影響，各因素對(duì)多糖得率影響大小依次為B>A>C，即超聲時(shí)間 > 乙醇濃度 > 超聲功率。

3.2.3 響應(yīng)面分析

利用Design-Expert軟件對(duì)各因素間交互作用進(jìn)行分析，得到響應(yīng)面圖以及等高線圖，結(jié)果見(jiàn)圖4至圖6。

圖4 乙醇濃度與提取時(shí)間對(duì)黃酮提取率影響的響應(yīng)面(左)和等高線(右)

圖5 乙醇濃度與超聲功率對(duì)黃酮提取率影響的響應(yīng)面(左)和等高線(右)

圖6 提取時(shí)間與超聲功率對(duì)黃酮提取率影響的響應(yīng)面(左)和等高線(右)

雙曲面坡度平緩表示2個(gè)因素交互作用不顯著，坡度陡峭表示2個(gè)因素交互作用顯著；等高線的密集程度和形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)度大小，等高線越密集，說(shuō)明二者交互作用越顯著；橢圓形表示2個(gè)因素交互作用顯著，圓形則表示2個(gè)因素的交互作用不顯著。圖4～圖6中，圖4與圖6中等高線圖近似橢圓，傾斜度相對(duì)圖5更高，表明兩張圖片所對(duì)應(yīng)的交互因素的交互作用明顯，圖5中等高線圖近似圓形，則表明該圖片中的交互因素交互作用不明顯。

3.2.4 最佳工藝條件的確定與驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)響應(yīng)面軟件可以得出，試驗(yàn)最佳工藝參數(shù)為乙醇濃度68.15%，提取時(shí)間27.04min，超聲功率304.91W，該條件下淡竹葉黃酮提取率為2.11%，為了試驗(yàn)操作的可行性與便利性，將工藝條件調(diào)整為乙醇濃度68%，提取時(shí)間27min，超聲功率305W。采用最佳工藝條件提取淡竹葉黃酮3次，進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，三次試驗(yàn)中淡竹葉黃酮提取率平均值為2.08%，與理論值2.11%相近，表明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳工藝條件準(zhǔn)確，具有一定的可行性。

3.3 淡竹葉黃酮抗氧化性能試驗(yàn)結(jié)果

淡竹葉黃酮對(duì)O2-、·OH、DPPH的清除作用結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7 黃酮抗氧化性能結(jié)果圖

由圖7可知，淡竹葉黃酮對(duì)這三種自由基具有一定的清除作用，并且清除效果隨著淡竹葉黃酮質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，但清除能力均比VC弱。當(dāng)?shù)袢~黃酮為0.5mg/mL時(shí)，對(duì)O2-·、·OH、DPPH·清除率分別為40.2%，73.0%，34.4%，表明在相同質(zhì)量濃度下，淡竹葉黃酮對(duì)·OH的清除效果最好。

4 結(jié)論

通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化得到淡竹葉黃酮提取最優(yōu)條件為乙醇濃度69%，提取時(shí)間27min，超聲功率304W。

淡竹葉黃酮對(duì)DPPH、O2-、·OH自由基具有一定的清除效果，并且清除效果隨著淡竹葉黃酮質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，IC50分別為1.12mg/mL、0.82 mg/mL、0.19 mg/mL。