王亨莉，鐘志娟 (中山大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東 珠海 519001)

葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD)缺乏癥是世界上最常見(jiàn)的紅細(xì)胞酶病。目前統(tǒng)計(jì)，約有4億人口存在G6PD缺陷。本病常見(jiàn)于瘧疾高發(fā)區(qū)、地中海貧血和異常血蛋白病等流行地區(qū)出現(xiàn)，地中海沿岸、東南亞、印度、非洲和美洲黑人的發(fā)病率較高[1]。我國(guó)分布規(guī)律呈“南高北低”的態(tài)勢(shì)，長(zhǎng)江流域以南，尤以廣東、海南、廣西、云南、貴州、四川等地為高發(fā)區(qū)，發(fā)生率為4%～15%，個(gè)別地區(qū)高達(dá)40%[2]。該病是由于調(diào)控G6PD的基因突變所導(dǎo)致的，是X連鎖不完全顯性遺傳，G6PD是紅細(xì)胞糖代謝戊糖磷酸途徑(包括GSH代謝途徑)中的一種重要酶類，其主要功能是生成潛在抗氧化劑紅細(xì)胞還原型輔酶Ⅱ(NADPH)，后者為維持谷胱甘肽還原狀態(tài)所必需[3]。G6PD基因異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致紅細(xì)胞糖代謝戊糖磷酸途徑代謝異常，NADP不能轉(zhuǎn)變成NADPH，后者不足則使體內(nèi)的兩個(gè)重要抗氧化損傷的物質(zhì)GSH及過(guò)氧化氫酶(CAT)不足，從而血紅蛋白和紅細(xì)胞膜均易于發(fā)生氧化性損傷[4]。臨床表現(xiàn)為溶血性貧血或蠶豆病。因此，尋求更方便、快捷的診斷方法有利于臨床上及時(shí)治療G6PD缺乏癥的患者。目前，臨床上常見(jiàn)的診斷手段有高鐵血紅蛋白還原法、熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)、硝基四氮唑藍(lán)紙片法[5]。高鐵血紅蛋白還原法簡(jiǎn)便快捷，但特異性較差，熒光斑點(diǎn)試驗(yàn)敏感性和特異性較高，但不夠快捷，硝基四氮唑藍(lán)紙片法特異性較差[6-9]。因此，尋找一種簡(jiǎn)便快捷、特異性高、靈敏度好的檢測(cè)方法有重要意義。本研究旨在探究熒光定量PCR對(duì)于G6PD缺乏癥患者的診斷價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取本科室自2018年1月～2018年10月接收的100份血樣(陰性標(biāo)本和陽(yáng)性標(biāo)本各50份)，入選本研究的血樣均應(yīng)符合以下的納入排除標(biāo)準(zhǔn)：納入標(biāo)準(zhǔn)：①陽(yáng)性血樣提供者經(jīng)診斷是G6PD缺乏癥患者；②陰性血樣提供者為健康正常人，無(wú)任何血液系統(tǒng)疾??；③血樣提供者BMI值在18.4～28.6 kg/m2范圍內(nèi)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有先天性心臟病或其他血管疾??；②患有惡性腫瘤的患者；③有肝腎疾病的患者；④有其他血液系統(tǒng)性疾病的患者。其中，陽(yáng)性標(biāo)本提供者(n=50)男28名，女22名，年齡6～42歲，平均為(28.9±3.2)歲；陰性標(biāo)本提供者(n=50)男25名，女26名，年齡8～38歲，平均為(28.1±3.5)歲。陰性標(biāo)本和陽(yáng)性標(biāo)本提供者的一般資料包括性別、年齡、BMI等比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2儀器及試劑：賽默飛ABI熒光PCR儀；AU5800系列全自動(dòng)生化分析儀；高鐵血紅蛋白還原實(shí)驗(yàn)MHBR試劑(0.0004M美蘭和2.5%NaNO等比例混合)；測(cè)定G6PD改良版試劑盒；TaqMan探針(美國(guó)Nova公司)；Taq酶(美國(guó)APE BIO公司)；引物(上海芯超生物科技有限公司)；QIA amp DNA Blood Mini Kit(上海芯超生物科技有限公司)。

1.3高鐵血紅蛋白還原法： 取新鮮的靜脈血0.9 ml，加入肝素抗凝劑0.1 ml,充分混勻，低速離心10 min，取出后調(diào)整血細(xì)胞和血漿的比例為1∶1后再次混勻，得到抗凝血。用移液槍移取上述抗凝血50 μl，并加入高鐵血紅蛋白還原實(shí)驗(yàn)MHBR試劑50 μl，充分混勻，在恒定溫度37 ℃條件下放置3 h，后取出加入4.9 ml蒸餾水，混合均勻，2 min后，即會(huì)顯色。若顏色為呈鮮紅色者，則是正常情況；若顏色呈棕色、紫色或者棕紅色則是缺乏G6PD。顏色與血紅蛋白的還原率有關(guān)，正常人還原率≥75%，對(duì)于G6PD缺陷癥患者來(lái)說(shuō)，高鐵血紅蛋白還原率降低，所呈現(xiàn)的顏色便不同[10-12]。

1.4熒光定量PCR：首先用QIA amp DNA Blood Mini Kit來(lái)提取得到DNA，若不能及時(shí)進(jìn)行PCR，則應(yīng)先儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱中。之后應(yīng)根據(jù)文獻(xiàn)查閱的該DNA可能存在的5個(gè)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物(由上海芯超生物科技有限公司合成)。然后混合的以下PCR反應(yīng)體系：2 μl DNA；1 μl引物；2 μl Taq酶;1 μl TaqMan探針；4 μl 5X Prime script Buffer 2。設(shè)定PCR程序是85 ℃預(yù)變性 515 min；85 ℃ 20 s，4 ℃ 10 μ，共30個(gè)循環(huán)；65 ℃ 30 s采集熒光信號(hào)。在賽默飛ABI熒光PCR儀分析數(shù)據(jù)[13-14]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：本研究所得所有數(shù)據(jù)及資料均使用SPASS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)數(shù)據(jù)及資料進(jìn)行t檢驗(yàn)，主要是得到數(shù)據(jù)的置信區(qū)間及數(shù)據(jù)是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。導(dǎo)入數(shù)據(jù)樣本，執(zhí)行“分析-比較均值-單樣本t檢驗(yàn)”，一般設(shè)定置信區(qū)間為95%，確定之后分析得結(jié)果，觀察P值，P>0.05時(shí)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義：當(dāng)P<0.05時(shí)，數(shù)據(jù)間存在的差異才有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

觀察組的特異性、靈敏度、陰性預(yù)測(cè)值、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、診斷符合率均顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 觀察組與對(duì)照組結(jié)果比較

3 討論

G6PD缺乏癥是一種遺傳病，發(fā)病率高，尋找有效快速方便的檢測(cè)手段對(duì)于臨床治療至關(guān)重要。本研究表明，熒光定量PCR是一種很好的檢測(cè)手段，比臨床傳統(tǒng)的高鐵血紅蛋白還原法有高特異性、高靈敏度、高陰性預(yù)測(cè)值、高陽(yáng)性預(yù)測(cè)值和高的診斷符合率。因此，熒光定量PCR可作為診斷 G6PD缺乏癥的新型技術(shù)手段在臨床上推廣[15]。但目前該技術(shù)尚存在局限性，如基因突變位點(diǎn)需要進(jìn)行篩查并合成相關(guān)引物，前期工作重大，但筆者認(rèn)為，隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，該技術(shù)所需的基因突變位點(diǎn)和相關(guān)引物會(huì)不斷完善。