萬敏 許美霞

(武漢市第四醫(yī)院ICU，湖北 武漢 430030)

心力衰竭屬于心血管疾病發(fā)展的終末階段并可促使患者死亡，其主要由心臟重構(gòu)、體液等異常造成的一種惡性循環(huán)〔1〕。研究表明心力衰竭發(fā)生過程涉及心肌細(xì)胞凋亡、肥大及血管新生等多個病理生理過程，其中心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生時還可通過促進病理性細(xì)胞肥大及間質(zhì)纖維化從而引發(fā)心肌重構(gòu)〔2〕。因而如何抑制心肌細(xì)胞凋亡成為延緩心力衰竭的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。羥考酮又稱鹽酸羥考酮，研究表明鹽酸羥考酮可減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷從而對心肌細(xì)胞發(fā)揮保護作用〔3〕。羥考酮可能通過調(diào)控P53，B淋巴細(xì)胞瘤(Bax)和B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bcl)-2mRNA的水平和VEGF，uPA的表達而抑制肺癌A549細(xì)胞增殖及遷移，促進其凋亡〔4〕。但關(guān)于鹽酸羥考酮對心肌細(xì)胞凋亡的作用尚未可知。異丙腎上腺素(ISO)屬于β受體激動劑，研究表明ISO可增加心肌耗氧量而造成心肌缺血、壞死等，ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷并可促使心肌細(xì)胞凋亡，故可用ISO建立體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞損傷模型〔5〕。抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路激活可減輕缺氧復(fù)氧環(huán)境下心肌細(xì)胞凋亡及氧化損傷〔6〕。研究表明通過抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)/p38MAPK信號通路激活可減輕心肌細(xì)胞氧化損傷而保護心肌細(xì)胞〔7〕。目前關(guān)于鹽酸羥考酮對心肌細(xì)胞損傷生物作用機制研究尚未完全闡明。因此，本研究通過檢測鹽酸羥考酮干預(yù)ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的凋亡相關(guān)指標(biāo)而探討鹽酸羥考酮對損傷心肌細(xì)胞的抗凋亡作用，擬從心肌細(xì)胞凋亡角度探析鹽酸羥考酮是否對ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷有抗凋亡作用，并初步探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 大鼠心肌細(xì)胞H9c2購自美國ATCC細(xì)胞庫。ISO購自美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基與胎牛血清均購自美國Gibco公司；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)與肌酸激酶(CK)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；噻唑藍(MTT)購自美國ENZO公司；Bcl-2、Bax抗體均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；磷酸化(p)-JNK、p-p38MAPK、JNK、p38MAPK抗體均購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的免疫球蛋白(Ig)G二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；鹽酸羥考酮購自英國Hamol公司(規(guī)格：0.5 mg/kg，批號：AW092)；p38MAPK特異性抑制劑SB203580購自美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1藥物處理及實驗分組 取出凍存心肌細(xì)胞H9c2，細(xì)胞復(fù)蘇，置于含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心機離心10 min，放入37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞傳代(2～3代)，取對數(shù)生長期心肌細(xì)胞，胰蛋白酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103個/ml，接種于6孔板，用10 μmol/L的ISO處理心肌細(xì)胞48 h(ISO組)，未進行任何處理的細(xì)胞作為對照組〔8〕。1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L的鹽酸羥考酮處理心肌細(xì)胞2 h〔9〕，用10 μmol/L的ISO處理心肌細(xì)胞48 h，分別為ISO+鹽酸羥考酮1 μmol/L組、ISO+鹽酸羥考酮5 μmol/L組、ISO+鹽酸羥考酮10 μmol/L組。后續(xù)實驗中為探究鹽酸羥考酮是否通過調(diào)控JNK/p38MAPK信號通路而發(fā)揮作用，用15 μmol/L的JNK/p38MAPK信號通路阻斷劑SB203580預(yù)處理24 h〔10〕，用10 μmol/L的ISO處理心肌細(xì)胞48 h，作為ISO+SB203580組。

1.2.2MTT檢測細(xì)胞增殖 將心肌細(xì)胞按照3×105個/ml的密度接種于96孔板，每組設(shè)置3個復(fù)孔，分別取各組100 μl細(xì)胞懸液加入對應(yīng)培養(yǎng)基內(nèi)，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔分別加入10 μl MTT溶液，室溫孵育4 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，每孔分別加入二甲基亞砜(DMSO)溶液150 μl，同時設(shè)置無細(xì)胞的空白孔加入等量DMSO溶液作為對照孔，低速振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測各孔吸光度(OD 490 nm)細(xì)胞存活率(%)=〔(實驗組-空白組)/(對照組-空白組)〕×100%。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組心肌細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌3次，使用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，收集細(xì)胞，低速離心后加入100 μl結(jié)合緩沖液制備單細(xì)胞懸液，依次加入5 μl Annexin V-FITC與PI，室溫避光孵育10 min，加入300 μl結(jié)合緩沖液終止反應(yīng)，充分混勻，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.2.4Western印跡檢測Bcl-2、Bax及JNK/p38MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達 收集各組對數(shù)生長期心肌細(xì)胞，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入裂解液裂解，4℃條件下，14 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，吸取蛋白上清液轉(zhuǎn)移至無菌無酶的EP管內(nèi)，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，取蛋白樣品加入等體積的2×加樣緩沖液，100℃煮沸5 min變性，取30 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后將其轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫條件下使用5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入一抗(稀釋比1∶800)，4℃反應(yīng)24 h，加入二抗(稀釋比1∶1 000)，室溫孵育1 h，滴加增強型電化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色，凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，應(yīng)用Quantityone軟件分析蛋白相對表達量(目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值)。

1.2.5檢測細(xì)胞上清液中LDH、CK含量 收集各組心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測LDH、CK含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗，方差分析，LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1鹽酸羥考酮對心肌H9c2細(xì)胞存活率的影響 用ISO處理心肌細(xì)胞后，與對照組比較，心肌細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)；與ISO組比較，不同濃度的鹽酸羥考酮處理心肌細(xì)胞后，心肌細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)，見表1。由于鹽酸羥考酮10 μmol/L處理后心肌細(xì)胞存活率相對較高，因此選取鹽酸羥考酮10 μmol/L進行后續(xù)研究。

2.2鹽酸羥考酮對心肌H9c2細(xì)胞凋亡率的影響 流式細(xì)胞儀檢測不同處理條件下心肌細(xì)胞凋亡率變化，結(jié)果顯示，與對照組比較，ISO組心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與ISO組比較，ISO+鹽酸羥考酮10 μmol/L組心肌細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。Western印跡實驗結(jié)果顯示，ISO組心肌細(xì)胞中Bax表達明顯上調(diào)(P<0.05)，而Bcl-2表達明顯下調(diào)(P<0.05)，鹽酸羥考酮處理后ISO+鹽酸羥考酮10 μmol/L組心肌細(xì)胞中Bax表達明顯下調(diào)(P<0.05)，而Bcl-2表達明顯上調(diào)(P<0.05)，見圖1、表2。

表1 鹽酸羥考酮對培養(yǎng)不同時間心肌H9c2細(xì)胞存活率的影響

與對照組比較:1)P<0.05；與ISO組比較:2)P<0.05，下表同

A：流式細(xì)胞儀檢測各組心肌細(xì)胞凋亡；B：Western印跡法檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達；1～3分別為對照組、ISO組、ISO+鹽酸羥考酮10 μmol/L組，圖2同

表2 鹽酸羥考酮對心肌H9c2細(xì)胞凋亡及上清液LDH、CK含量的影響

2.3鹽酸羥考酮對心肌H9c2細(xì)胞上清液中LDH、CK含量的影響 與對照組比較，ISO組心肌細(xì)胞上清液中LDH、CK含量均顯著升高(P<0.05)；與ISO組相比，ISO+鹽酸羥考酮10 μmol/L組心肌細(xì)胞上清液中LDH、CK含量均顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.4鹽酸羥考酮對心肌H9c2細(xì)胞JNK/p38MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達的影響 與對照組比較，ISO組心肌細(xì)胞中p-JNK、p-p38MAPK蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)；與ISO組比較，ISO+鹽酸羥考酮10 μmol/L組心肌細(xì)胞中p-JNK、p-p38MAPK蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，見表3、圖2。

表3 鹽酸羥考酮對心肌H9c2細(xì)胞JNK/p38MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達的影響

圖2 Western印跡法檢測各組心肌細(xì)胞中JNK/p38MAPK信號通路相關(guān)蛋白表達

2.5阻斷JNK/p38MAPK信號通路對心肌H9c2細(xì)胞存活率及凋亡率的影響 與對照組比較，ISO組心肌細(xì)胞存活率顯著降低，而細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bcl-2表達顯著下降，Bax表達顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。與ISO組比較，ISO+SB203580組心肌細(xì)胞存活率顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bcl-2表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而Bax表達下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表4、圖3。

表4 阻斷JNK/p38MAPK信號通路對心肌H9c2細(xì)胞存活率及凋亡率的影響

1～3：對照組、ISO組、ISO+SB203580組

3 討 論

心肌細(xì)胞凋亡與心室重構(gòu)均可加重心力衰竭，并可影響心房肌細(xì)胞凋亡及纖維化，細(xì)胞凋亡是心血管疾病、自身免疫性疾病等多種疾病發(fā)生的重要機制之一〔11〕。心肌細(xì)胞本身不具有增殖能力，隨著心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量增加明顯減弱心臟收縮功能甚至誘發(fā)心力衰竭〔12〕。因此，通過某些措施干預(yù)心肌細(xì)胞凋亡過程中的相關(guān)信號通路或轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可為心血管疾病治療提供新方向。

鹽酸羥考酮屬于阿片類藥物，其可通過激活μ受體、κ受體而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，并可通過調(diào)控細(xì)胞因子或趨化因子等表達而調(diào)控機體免疫功能〔13〕。研究表明阿片類藥物可通過調(diào)控癌細(xì)胞增殖及凋亡等途徑進而發(fā)揮抗癌作用〔14,15〕。本研究結(jié)果與相關(guān)文獻報道相似〔16〕。說明鹽酸羥考酮可促進ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活而抑制其凋亡，其可能通過調(diào)控細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達進而發(fā)揮作用。提示鹽酸羥考酮可有效抑制心肌細(xì)胞凋亡并促進其存活。研究報道指出心肌細(xì)胞或組織壞死時LDH、CK釋放量增加，活性增強，預(yù)示心肌細(xì)胞損傷程度加重〔17〕。說明ISO可促使心肌細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重?fù)p傷，鹽酸羥考酮可有效減輕ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。提示鹽酸羥考酮具有抗氧化及減輕ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的作用。

心肌缺血再灌注損傷發(fā)生后心肌細(xì)胞內(nèi)JNK/p38MAPK信號通路激活，各種炎性細(xì)胞因子生成量明顯增加，進一步促進心肌細(xì)胞凋亡而加重心肌缺血再灌注損傷〔18〕。JNK/p38MAPK信號通路激活后可通過與底物結(jié)合而影響組織炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖及凋亡等過程，研究表明JNK/p38MAPK信號通路活化與細(xì)胞凋亡有關(guān)〔19,20〕。本研究結(jié)果提示鹽酸羥考酮可能通過抑制JNK/p38MAPK信號通路的活化進而減輕ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷后炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中加入JNK/p38MAPK信號通路阻斷劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷及細(xì)胞凋亡的作用與鹽酸羥考酮的作用效果相似。提示鹽酸羥考酮可能通過抑制JNK/p38MAPK信號通路的激活，抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞氧化損傷，減少細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮對ISO誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的保護作用。

綜上，鹽酸羥考酮通過降低氧化應(yīng)激水平及抑制ISO誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡而保護心肌細(xì)胞，其可能通過抑制JNK/p38MAPK信號通路的激活而發(fā)揮作用，為臨床治療心力衰竭藥物的研發(fā)及應(yīng)用提供理論依據(jù)。