李鴻敏 周碎平 華巖

(1河南警察學(xué)院洛陽校區(qū)，河南 洛陽 471002；2重慶師范大學(xué)涉外商貿(mào)學(xué)院；3南寧師范大學(xué)體育與健康學(xué)院)

脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，含有大量的巨噬細(xì)胞與淋巴細(xì)胞，能清除血液中病毒、異物、衰老死亡細(xì)胞等，此外，脾臟還制造補(bǔ)體、免疫球蛋白等。長期大強(qiáng)度運動會影響脾臟免疫功能，例如淋巴細(xì)胞數(shù)量減少、巨噬細(xì)胞活性降低等〔1，2〕。所以，常有運動員在比賽或者訓(xùn)練后，機(jī)體免疫功能下降，對病毒的抗感染能力降低，易患感冒、呼吸道感染、病毒肝炎等疾病，嚴(yán)重影響后續(xù)的比賽和訓(xùn)練。因此，了解大強(qiáng)度運動后脾臟免疫功能的變化特征，對今后的比賽與訓(xùn)練具有重要的意義。目前研究中，較少觀察運動后恢復(fù)期間脾臟淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞亞群、巨噬細(xì)胞的動態(tài)變化特征。本研究，擬通過建立大鼠長期大強(qiáng)度運動模型，探討運動后恢復(fù)期間大鼠脾臟淋巴細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞亞群、巨噬細(xì)胞的變化，旨在為大強(qiáng)度運動后免疫功能的變化規(guī)律提供實驗依據(jù)

1 對象與方法

1.1實驗對象與分組 健康雄性SD大鼠45只，2月齡動物房內(nèi)分籠飼養(yǎng)，每籠5只，喂食國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類飼料。動物房濕度40%～60%，溫度25℃±2℃。實驗前，進(jìn)行為期7 d的適應(yīng)跑臺練習(xí)，每天10 min，定速10 m/min，期間淘汰5只不肯跑大鼠，剩余大鼠40只(體重192 g±22.1 g)。

大鼠隨機(jī)分兩組：安靜組(A組，n=10)，運動組(B組，n=30)。訓(xùn)練末期，運動組大鼠因為訓(xùn)練不當(dāng)死亡3只。在最后一次力竭運動后，根據(jù)不同取材時間，將運動組小鼠分為B1組(運動后即刻取材)、B2組(運動后12 h取材)，B3組(運動后24 h取材)，每組9只。

1.2實驗方法

1.2.1主要儀器 臺式電子體重稱(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)、跑臺(江蘇賽昂斯生物科技)、超凈工作臺(蘇州安泰技術(shù)有限公司)、酶標(biāo)儀(BIO-RAD，美國)、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國)、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(SANYO，日本)、流式細(xì)胞儀(美國Beckman-coulter公司)等。

1.2.2主要試劑 脂多糖(LPS，購于美國Sigma公司)、RPMII640培養(yǎng)液(購于南京建成生物研究所)、磷酸鹽緩沖液(PBS，自配)、生理鹽水(自配)、噻唑藍(lán)(MTT，購于Amresco公司)、二甲基亞砜(DMSO，購于美國Amresco公司)、淋巴細(xì)胞分離液(購于中生北控生物科技股份有限公司)、CD4+、CD8+單克隆抗大鼠抗體(購于南京建成生物研究所)、刀豆蛋白A(ConA，購于美國Sigma公司)、中性紅(南京建成生物研究所)等。

1.2.3運動方案 A組：正常飲食、進(jìn)水，不運動。

運動組：運動方案參考國內(nèi)外學(xué)者〔3，4〕并加以改進(jìn)。訓(xùn)練9 w，每周6 d，周日休息，前8 w為遞增負(fù)荷訓(xùn)練，第9周為力竭訓(xùn)練(力竭判定：大鼠臀部壓籠子后端，后肢滯后與跑臺皮帶轉(zhuǎn)速約30 s，跟不上跑臺速度，對大鼠刺激、驅(qū)趕無效。)。第1周，速度18 m/min，坡度0%，時間20 min/d；第2周，速度22 m/min，坡度2%，時間20 min/d；第3周，速度25 m/min，坡度5%，時間20 min/d；第4周、第5周，速度28 m/min，坡度5%，時間30 min/d；第6周，速度28 m/min，坡度8%，時間50 min/d；第7周、第8周，速度32 m/min，坡度10%，時間50 min/d；第9周，速度32 m/min，坡度10%，力竭。

1.2.4動物取材、脾臟淋巴細(xì)胞懸液的制備與指標(biāo)的測定 動物取材：末次訓(xùn)練后，A組、B1組大鼠輕度麻醉，稱重，無菌條件下摘除大鼠脾臟，剔除脾臟的結(jié)締組織與脂肪組織。B2組、B3組取材時間為運動后12 h、運動后24 h。

脾臟淋巴細(xì)胞懸液的制備：將脾臟研磨(采用200目不銹鋼濾網(wǎng))，倒入含有PBS的培養(yǎng)皿中，以1 500 r/min，離心3 min后，取脾細(xì)胞沉淀。脾細(xì)胞沉淀加入紅細(xì)胞裂解液，以2 000 r/min離心20 min，去上清，取細(xì)胞懸液。用PBS洗滌2次脾細(xì)胞懸液，染液染色3 min，在活細(xì)胞數(shù)大于95%，RPMII640培養(yǎng)液制備脾細(xì)胞懸液(計數(shù)細(xì)胞后調(diào)整所需濃度為1×107細(xì)胞/ml)。制備的淋巴細(xì)胞懸液用于T淋巴細(xì)胞增殖能力、B淋巴細(xì)胞增殖能力、CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)；脾臟巨噬細(xì)胞吞噬能力的測定。

指標(biāo)的測定：MTT法分別檢測大鼠脾臟T淋巴細(xì)胞增殖能力、B淋巴細(xì)胞增殖能力；流式細(xì)胞儀檢測CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)；中性紅比色法測定脾臟巨噬細(xì)胞吞噬能力。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組T淋巴細(xì)胞增殖、B淋巴細(xì)胞增殖比較 與A組相比，B1組、B2組T淋巴細(xì)胞增殖、B淋巴細(xì)胞增殖顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)，B3組T淋巴細(xì)胞增殖、B淋巴細(xì)胞增殖略低，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與B1相比，B2組、B3組T淋巴細(xì)胞增殖、B淋巴細(xì)胞增殖顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05、P<0.01)；與B2組相比，B3組T淋巴細(xì)胞增殖、B淋巴細(xì)胞增殖顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 各組T淋巴細(xì)胞增殖、B淋巴細(xì)胞增殖比較

與A組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與B1組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與B2組比較：5)P<0.05，6)P<0.01；下表同

2.2各組T淋巴細(xì)胞亞群比較 與A組相比，B1組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01、P<0.05)，B2組CD4+、CD4+/CD8+顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01、P<0.05)，CD8+差異無統(tǒng)計學(xué)意義，B3組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與B1組相比，B2組、B3組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01、P<0.05)；與B2組相比，B3組CD4+顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，CD8+、CD4+/CD8+差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表2 各組CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比較

2.3各組脾臟巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞比較 與A組(0.42±0.07)相比，B1組巨噬細(xì)胞吞噬能力顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(0.30±0.05，P<0.01)，B2組(0.39±0.05)、B3組(0.42±0.05)巨噬細(xì)胞吞噬能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與B1相比，B2組、B3組巨噬細(xì)胞吞噬能力顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與B2組相比，B3組巨噬細(xì)胞吞噬能力差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討 論

大強(qiáng)度運動導(dǎo)致機(jī)體免疫功能受到抑制〔1，2，5〕。本研究前8 w為遞增負(fù)荷訓(xùn)練，第9周為力竭運動，根據(jù)Bedford等〔3〕的研究推斷(不同的速度、坡度與攝氧量之間的關(guān)系)，第1～5周的運動速度為18～28 m/min，坡度為5，時間20～30 min，小于65%最大吸氧量；第6周速度28 m/min，坡度為8，時間50 min，大于85%最大吸氧量；第7～8周，運動速度32 m/min，坡度為10，時間50 min，大于95%最大吸氧量；第9周，力竭運動，應(yīng)屬于100%最大吸氧量。訓(xùn)練結(jié)束后，B組T淋巴細(xì)胞增殖能力、B淋巴細(xì)胞增殖能力、CD4+/CD8+比值、巨噬細(xì)胞吞噬能力，均顯著降低，結(jié)果表明，大鼠脾臟免疫功能受到抑制。

脾臟中B淋巴細(xì)胞主要介導(dǎo)體液免疫(產(chǎn)生抗體，提呈抗原及分泌細(xì)胞內(nèi)因子參與免疫調(diào)節(jié))，T細(xì)胞主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫(抗胞內(nèi)感染、瘤細(xì)胞與異體細(xì)胞等)〔6,7〕。T細(xì)胞的許多功能是通過其亞群發(fā)揮作用的，例如，CD8+(毒性T細(xì)胞)直接殺傷或者抑制被病毒感染的靶細(xì)胞。CD4+(輔助性T細(xì)胞)分泌的細(xì)胞因子抗病毒、腫瘤〔8〕。研究認(rèn)為，隨著運動時間、運動強(qiáng)度的增加，機(jī)體的胸腺、脾臟會發(fā)生形態(tài)和功能的改變，脾臟的萎縮會損壞骨髓結(jié)構(gòu)的變化，直接損害淋巴細(xì)胞的發(fā)源地，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞增殖能力降低，CD8+、CD4+、CD4+/CD8+顯著降低等〔9～14〕。

本研究結(jié)果提示，大強(qiáng)度運動導(dǎo)致大鼠免疫功能受到抑制，脾臟T淋巴細(xì)胞增殖、B淋巴細(xì)胞增殖、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+降低，恢復(fù)期間逐步上升，其中CD8+、CD4+/CD8+在恢復(fù)12 h基本達(dá)到正常狀態(tài)，T淋巴細(xì)胞增殖、B淋巴細(xì)胞增殖、CD4+在24 h達(dá)到正常狀態(tài)。也有報道表明，急性遞增負(fù)荷后，T淋巴細(xì)胞水平及CD4+/CD8+顯著下降，在24 h后T淋巴細(xì)胞水平及CD4+/CD8+達(dá)正常狀態(tài)〔15〕。

巨噬細(xì)胞是重要的免疫細(xì)胞，具有吞噬病毒、殺傷、抗原遞呈、分泌等作用有研究認(rèn)為，大強(qiáng)度運動導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的活性氧成分流失，巨噬細(xì)胞能力下降〔16,17〕。本研究結(jié)果提示，大強(qiáng)度運動導(dǎo)致大鼠脾臟中巨噬細(xì)胞吞噬能力降低，恢復(fù)期間12 h后基本達(dá)到正常水平。

綜上，大強(qiáng)度運動后，大鼠脾臟、B淋巴細(xì)胞、T淋巴增殖能力降低、巨噬細(xì)胞吞噬能力降低、CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+降低，恢復(fù)期間逐步上升，其中CD8+、CD4+/CD8+、巨噬細(xì)胞吞噬能力在恢復(fù)期12 h基本達(dá)到正常狀態(tài)，T淋巴細(xì)胞增殖能力、B淋巴細(xì)胞增殖能力、CD4+在恢復(fù)期24 h達(dá)到正常狀態(tài)。