巫旭娜 許碧蓮 田佳 吳迪生 古劍雄

(1廣東醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣東 湛江 524023；2東莞市第八人民醫(yī)院藥劑科；3廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院)

骨質(zhì)疏松(OP)是一種以低骨量和骨組織微結(jié)構(gòu)退化為特征的進(jìn)行性系統(tǒng)性骨骼疾病，最終導(dǎo)致骨質(zhì)脆性增加和易于骨折〔1〕。OP可發(fā)生于不同年齡和性別，但多見于絕經(jīng)后婦女。骨性關(guān)節(jié)炎(OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨退化、關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下骨增生，繼而導(dǎo)致關(guān)節(jié)間隙狹窄為特征的關(guān)節(jié)慢性退行性疾病〔2〕。OA在中老年人中有較高的發(fā)病率，女性多于男性，特別多見于絕經(jīng)后婦女〔3〕。OP與OA雖各自有著不同的病理變化和病因，但都屬于與年齡、性別有關(guān)的退行性病變，且絕經(jīng)后婦女多見。全世界60%的絕經(jīng)后婦女面臨著這兩大疾病的威脅〔4〕。因此，如何防治絕經(jīng)后婦女的OP和OA，是人們亟待解決的問題。然而，在當(dāng)前的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究中缺少穩(wěn)定的OP合并OA的實(shí)驗(yàn)動物模型。適合的實(shí)驗(yàn)動物模型是作為大規(guī)模實(shí)驗(yàn)研究的基礎(chǔ)，多年以來國內(nèi)外報(bào)道了多種動物模型，然而各種模型的研究仍有待深入〔5，6〕。微計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(Micro-CT)是一種非破壞性的三維(3D)成像技術(shù)，可以在不破壞樣本的情況下清楚了解樣本的內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)采用兩側(cè)去卵巢(OVX)和膝關(guān)節(jié)腔中注射碘乙酸鈉(MIA)兩種方法相結(jié)合建立大鼠OP合并OA模型，并通過Micro-CT來確認(rèn)評價(jià)，為臨床上研究OP合并OA提供實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1動物及藥品 18只3月齡雌性SD大鼠，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心(合格證號：SCXK桂2014-0002)，平均體重(246±22)g。適應(yīng)性飼養(yǎng)1個月，開始實(shí)驗(yàn)時平均體重為(300±15)g。MIA購自美國Sigma公司(批號：19148)，viva Micro-CT 40(SCANCO Medical AG，瑞士)。

1.2動物分組及模型制備 18只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)(Sham)組、兩側(cè)OVX組、兩側(cè)OVX+MIA組，每組6只。大鼠OVX手術(shù)在無菌條件下進(jìn)行，采用戊巴比妥鈉25 mg/kg行腹腔注射麻醉，先行背部雙側(cè)腰椎旁1.5 cm處，縱行切口進(jìn)入腹腔，除假手術(shù)組僅暴露卵巢不切除，其余組大鼠切除兩側(cè)卵巢，結(jié)扎卵巢動脈依次縫合肌肉層和皮膚制作OVX的OP模型〔7〕。4 w后在無菌條件下，又用戊巴比妥鈉25 mg/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉，用醫(yī)用酒精消毒關(guān)節(jié)附近的鼠毛和皮膚，Sham和OVX組大鼠于右膝髕骨下韌帶處于關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入無菌生理鹽水50 μl，而OVX+MIA組大鼠用同樣的方法于右膝關(guān)節(jié)腔中注入配制好的MIA溶液50 μl〔8〕。12 w后，將大鼠麻醉并進(jìn)行心臟取血處死，取右側(cè)股骨和脛骨并用生理鹽水紗布和錫紙包裹，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3股骨松質(zhì)骨Micro-CT測量 解凍右側(cè)股骨，將標(biāo)本垂直固定于固定器內(nèi)，使標(biāo)本骨骺端保持一致的方向，每6個標(biāo)本放置一層，進(jìn)行Micro-CT掃描。viva CT40選擇的掃描參數(shù)：圖像矩陣：2 048×2 048×223，整合時間：200 ms，能量/強(qiáng)度：70 kVp、114 μA、8 W，CT值以1 200 mg HA/cm進(jìn)行校正，0°旋轉(zhuǎn)掃描。掃描完成后，對股骨松質(zhì)骨分析是從縱切面距離生長板遠(yuǎn)端1.0 mm處開始、共層厚3.0 mm的松質(zhì)骨為測量區(qū)域進(jìn)行重組獲得3D圖像，圖像信息為最低閾值170。對骨組織重組的圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)定量分析，可得到以下定量參數(shù)值：骨密度(BMD)、連接密度(Conn.D.)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)和骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.4脛骨關(guān)節(jié)面軟骨micro-CT測量 解凍右側(cè)脛骨，在脛骨近心端1/3處用低速鋸沿著橫切面鋸斷，獲得脛骨上段，保留脛骨中段。將脛骨上段關(guān)節(jié)面浸泡于泛影葡胺顯影液，水浴鍋加熱至37℃，恒溫浸泡20 min取出。將一根脛骨垂直固定于固定器內(nèi)，放入合適的掃描管內(nèi)，viva CT40選擇掃描參數(shù)：圖像矩陣為2 048×2 048×223，整合時間：200 ms，能量/強(qiáng)度：45 kVp、177 μA、8 W，CT值以1 200 mg HA/cm校正，0°旋轉(zhuǎn)，進(jìn)行掃描。掃描完成后，對骨組織重組圖像進(jìn)行3D旋轉(zhuǎn)，以確保橫向軸與垂直軸對齊，進(jìn)行定量分析內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)面軟骨厚度時選取以正中心前后各2.0 mm，共層厚4.0 mm的關(guān)節(jié)組織為測量區(qū)域進(jìn)行重組三維圖像，圖像信息為最低閾值170。在對應(yīng)的關(guān)節(jié)面測量區(qū)域下對軟骨層進(jìn)行3D圖像重組?？色@得以下定量參數(shù)：軟骨體積、軟骨厚度。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，組間比較使用單因素方差分析，方差齊時采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時采用TamhaneT2檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組股骨松質(zhì)骨Micro-CT定量參數(shù)的變化 與Sham組比較，OVX組和OVX+MIA組BMD、BV/TV、Tb.N和Conn.D均明顯減小(P<0.01)，Tb.Sp和SMI均明顯增大(P<0.01)。見表1。

2.2各組股骨Micro-CT的二維(2D)和3D結(jié)構(gòu)圖的變化 由圖1可見，Sham組大鼠股骨骨小梁連接和分布緊密，骨2D和3D結(jié)構(gòu)完整；OVX和OVX+MIA組的骨小梁數(shù)目減少且出現(xiàn)骨小梁多部位缺失、骨2D和3D結(jié)構(gòu)明顯破壞。

表1 各組股骨松質(zhì)骨Micro-CT定量參數(shù)的變化

與Sham組比較:1)P<0.01

圖1 各組股骨松質(zhì)骨Micro-CT的2D和3D結(jié)構(gòu)

2.3各組脛骨關(guān)節(jié)面內(nèi)側(cè)軟骨Micro-CT定量參數(shù)的變化 與Sham組比較，OVX+MIA組軟骨厚度、軟骨體積均明顯減小(P<0.05，P<0.01)，而OVX組軟骨厚度、軟骨體積均無明顯差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組脛骨關(guān)節(jié)面內(nèi)側(cè)軟骨Micro-CT定量參數(shù)的變化

與Sham組比較:1)P<0.05,2)P<0.01

2.4大鼠脛骨關(guān)節(jié)面內(nèi)側(cè)軟骨Micro-CT的軟骨厚度2D和3D結(jié)構(gòu)圖的變化 脛骨內(nèi)側(cè)軟骨Micro-CT的2D結(jié)構(gòu)圖中軟骨層的綠色面積越大代表該區(qū)域軟骨厚度越厚，3D結(jié)構(gòu)圖中紅色越深代表該區(qū)域軟骨厚度越厚。與Sham組比較，OVX+MIA組軟骨厚度明顯變薄，而OVX組大鼠軟骨厚度稍為變薄。見圖2。

圖2 各組脛骨內(nèi)側(cè)軟骨Micro-CT的軟骨厚度2D及3D結(jié)構(gòu)

3 討 論

Micro-CT 能夠在微米級分辨率下對硬組織進(jìn)行3D形態(tài)定量分析，比2D體視學(xué)定量方法更準(zhǔn)確、更科學(xué)、更全面反映硬組織包括骨在內(nèi)的一些材料微觀結(jié)構(gòu)，能獲得真正的各項(xiàng)同性的容積圖像，提高空間分辨率〔9〕。Micro-CT不能對軟組織如關(guān)節(jié)軟骨直接進(jìn)行掃描，因?yàn)檐浗M織的X射線吸收率比較低。文獻(xiàn)報(bào)道〔10〕，應(yīng)用泛影葡胺造影劑結(jié)合Micro-CT掃描的方法，從Micro-CT掃描圖像中不但能夠清晰地看到軟骨區(qū)域，還可以通過重建方法將軟骨整體形態(tài)以3D形式呈現(xiàn)出來，可以進(jìn)行軟骨厚度和體積測量。

本研究結(jié)果提示，OVX+關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA制備OP合并OA的大鼠模型是成功的，而單純OVX不能制備OP合并OA的大鼠模型。文獻(xiàn)報(bào)道〔11〕，單純OVX對關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)和軟骨細(xì)胞數(shù)量沒有影響，單純OVX不能導(dǎo)致OA。但也有研究報(bào)道，單純OVX可導(dǎo)致OA〔12〕。雌激素水平對關(guān)節(jié)軟骨也有影響，在軟骨上有雌激素的受體，雌激素缺乏時會使軟骨發(fā)生退化〔13〕。因此，單純OVX制備OP合并OA的動物模型，還尚未得到一致的結(jié)果。

OVX模型是模擬絕經(jīng)后OP的經(jīng)典模型，關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA是誘導(dǎo)OA常用的動物模型，本實(shí)驗(yàn)采用OP模型和OA動物模型相結(jié)合的方法直接模擬絕經(jīng)后婦女OP合并OA大鼠模型。大鼠去卵巢后，雌激素缺乏。雌激素缺乏導(dǎo)致OP的主要機(jī)制與多種炎癥因子有關(guān)包括白細(xì)胞介素(IL)-1、IL-6、IL-7、腫瘤壞死因子(TNF)-α和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)，當(dāng)雌激素缺乏時這些炎癥因子會分泌增加。這些細(xì)胞因子又會誘導(dǎo)破骨細(xì)胞形成和促進(jìn)骨吸收〔14〕。另外，當(dāng)雌激素缺乏時垂體-衍生促卵泡激素分泌增加，破骨細(xì)胞和它們前體具有促卵泡激素的受體，因此增強(qiáng)了破骨細(xì)胞的活性〔15〕。骨吸收增強(qiáng)，導(dǎo)致骨重建失衡，雖然耦聯(lián)骨形成增加，但骨吸收大于骨形成，從而導(dǎo)致OP。

MIA能導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的降解和軟骨細(xì)胞的凋亡〔16〕，引起軟骨的降解和丟失、軟骨基質(zhì)的改變、滑膜炎癥等類似于人骨關(guān)節(jié)炎的病變〔17〕。MIA誘導(dǎo)的原代大鼠軟骨細(xì)胞凋亡主要與活性氧的產(chǎn)生及線粒體介導(dǎo)的 caspase-3活化有關(guān)〔18〕，但是其確切的機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采用切除大鼠兩側(cè)卵巢和膝關(guān)節(jié)腔中注射MIA制備OP合并OA模型是可行的，通過Micro-CT掃描重建進(jìn)行評價(jià)是可靠的。這一模型為OP合并OA藥物防治研究提供基礎(chǔ)依據(jù)。