張國銳 賈林 楊曉萍 趙瑾 陶林

(石河子大學醫(yī)學院 1第一附屬醫(yī)院腎病科，新疆 石河子 832000；2病理教研室)

慢性腎臟疾病(CKD)發(fā)展至終末期腎衰竭的主要病理基礎和共同途徑是腎間質纖維化(RIF)，成纖維細胞及肌成纖維細胞(MyoF)異常增生，過量的細胞外基質(ECM)，在腎間質內(nèi)沉積最終導致纖維化，活性維生素D3除經(jīng)典的調節(jié)鈣磷代謝作用外，還具有多種其他生物學效應，CKD病人通常較正常人存在低活性維生素D3，推測活性維生素D3減少可能參與腎臟疾病的發(fā)生與發(fā)展，有研究發(fā)現(xiàn)其可以保護足細胞，增加腎小球腎病蛋白(Nephrin)的表達，減少尿蛋白，改善腎臟功能〔1〕。近期亦有研究發(fā)現(xiàn)活性維生素D3可以改善RIF，目前未明確其具體機制。本試驗通過建立單側輸尿管梗阻(UUO)腎間質纖維化模型，觀察活性維生素D3對P38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)及磷酸化(p)-P38MAPK蛋白表達的影響，探討活性維生素D3改善RIF的機制。

1 資料和方法

1.1實驗方案及模型建立

1.1.1主要實驗試劑和試驗動物 活性維生素D3由青島海爾制藥公司提供，以花生油為溶劑，配制濃度為0.5 μg/ml，兔抗人p-P38MAPK單克隆抗體、兔抗人P38MAPK單克隆抗體 、小鼠抗人β-action單克隆抗體(美國Cell Signaling公司);辣根過氧化物酶標記的山羊抗免疫球蛋白(Ig)G二抗(中國北京中杉金橋)；Masson三色染色試劑盒(福州邁新生物工程有限公司)。4周齡清潔級健康雄性SD大鼠54只，體重(200±20)g，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心購得，石河子大學醫(yī)學院中心實驗室中適應性喂養(yǎng)1 w，室溫下自然飲水、進食(石河子大學實驗動物中心提供飼料)。

1.1.2大鼠模型分組 54只雄性SD大鼠，隨機分為UUO模型組(模型組)、活性維生素D3干預組(干預組)、假手術組，模型組和干預組共計36只大鼠，大鼠左腎下極處游離并結扎左輸尿管，建立UUO模型； 18只SD大鼠開腹后僅游離左輸尿管，作為假手術組；干預組在建模起給予1 ml花生油，其中加入活性維生素D30.5 μg，每天1次灌胃，共計14 d，而假手術組、模型組每天僅給予花生油1 ml灌胃。

1.1.3標本收集 分別于術后第3、7、14天處死3組大鼠各6只，收集左側腎臟標本。把左側腎臟標本分成兩份，一份用4%甲醛固定后制成蠟塊，另一份立即用生理鹽水沖洗，然后放在液氮罐中用于蛋白質的提取，蠟塊由專業(yè)技師切成3 μm厚的切片，病理染色用。避免取材過程中的污染。

1.2免疫組化染色 HE染色：將切片在60℃烤箱中烤15～20 min；常規(guī)脫蠟，切片用清水沖洗水化；放入蘇木素染液中染色5 min，取出用清水沖洗3 min；鹽酸酒精(1%)水化15 s，再次清水沖洗1 min；將切片放入清水中，5 min藍化；取出后切片放入伊紅染液中染色2 min，然后清水沖洗；切片依次在80%酒精、90%酒精、95%酒精、無水酒精中浸泡5 min脫水；二甲苯Ⅰ、Ⅱ中各浸泡5 min；蓋玻片固定，封片，晾干；

Masson染色：將切片在60℃烤箱中烤15～20 min；常規(guī)脫蠟，自來水沖洗切片水化；滴加100 μl Masson復合染色液5 min，蒸餾水沖洗；滴加100 μl磷鉬酸染色5 min，甩干；滴加100 μl苯胺藍染色，染色5 min，蒸餾水沖掉，擦干；滴加100 μl分化液，分化30～60 s；梯度酒精依次脫水5 min，然后二甲苯透明5 min；中性樹膠固定，封片晾干。

光鏡下觀察腎小管間質損害程度并進行病理分級，石河子大學病理教研室兩位專家單獨觀察結果。間質損害結果的判定方法： 0級(0分)：無病理損害表現(xiàn)；Ⅰ級(1分)：局部可見少量炎性細胞，輕度的腎小管擴張，未見到明顯腎間質纖維化，病理損害范圍< 25%；Ⅱ(2分)級：炎性細胞局灶浸潤，中度腎小管擴張，可見萎縮，腎間質可見成纖維細胞彌漫分布，病理損害范圍25%～49%；Ⅲ級(3分)：可見大量炎性細胞，彌漫分布，重度腎小管壞死，RIF明顯，腎臟病理損害范圍≥50%。陽性結果判定：選高倍鏡下(×400)5個小管間質視野(避開腎小球和大血管)量化染色細胞的面積和強度，算出平均值，最后結果為兩位專家的結果均值。

1.3Western印跡法檢測P38MAPK、p-P38MAPK表達 適量的腎組織充分研磨，置于RIPA 勻漿緩沖液中勻漿，4℃，離心力12 000 r/min，離心20 min，取上清液，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白檢測試劑盒測定蛋白濃度。配平后加入5×上樣緩沖液，使用掌心式離心機離心30 s，混勻后將EP管置于水浴鍋中，100℃，8 min煮沸；待蛋白冷卻后，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

預制的10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠中加入適量的組織勻漿標本蛋白，電泳分離，轉膜，封閉，洗滌后，用含P38MAPK及p-P38MAPK及β-actin 抗體的5%脫脂牛奶三乙醇胺緩沖鹽水溶液(TBS)平衡液孵育。洗滌后，再用5% 脫脂牛奶TBS平衡液，其中含辣根過氧化酶標記二抗，孵育標本膜。再次充分洗滌后，使用電化學發(fā)光(ECL)試劑盒顯影曝光；曝光后采用凝膠成像儀采圖、Gel-Pro analyzer分析系統(tǒng)進行灰度分析。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1腎臟病理損害 模型組隨建模時間的延長，腎間質增寬，炎細胞的浸潤范圍增大，間質細胞增生明顯，纖維化逐漸加重，與假手術組比較病理積分差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；干預組炎細胞浸潤、纖維化程度較模型組顯著減輕，病理積分差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 不同時間三組大鼠腎小管間質損害程度積分

與假手術組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.05；下表同

圖1 腎臟免疫組化染色(×400)

2.2Western印跡法檢測 與假手術組相比，模型組p-P38MAPK蛋白表達量隨時間延長顯著增加(P<0.01)；干預組p-P38MAPK蛋白表達量較模型組顯著減少(P<0.05)；P38MAPK蛋白表達量各組無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2、表3、圖2。

表2 各組不同時間p-P38MAPK蛋白表達

表3 各組不同時間P38MAPK蛋白表達

F：假手術組；M：模型組；U：干預組；β：β-actin

3 討 論

目前應用最為廣泛的研究RIF的實驗動物模型是UUO模型。手術結扎單側輸尿管，腎臟積水,導致腎臟功能的改變并慢性腎臟結構的損害，因腎積水,腎血流稀疏，巨噬細胞浸潤,纖維細胞增殖,進而形成瘢痕,最終導致RIF,出現(xiàn)腎衰竭。該模型已成熟，且相對制作簡單,重復性較好,RIF發(fā)生迅速,可觀察到腎臟細胞轉分化過程。

1，25-二羥維生素D3〔1,25-(OH)2D3〕是體內(nèi)維生素D3的活性形式，它能夠調節(jié)機體免疫系統(tǒng)的功能，對多種細胞的增殖有抑制作用，誘導多種細胞的凋亡和分化，保護基因，對臟器有保護功能〔1〕。1,25-(OH)2D3可通過多種途徑改善或延緩RIF的過程，但其機制尚不清楚〔2〕。

RIF與腎小管上皮細胞-肌成纖維細胞轉分化(TEMT)過程關系密切；研究表明腎小管上皮細胞可以通過TEMT過程轉變成為可以分泌ECM的MyoF，參與RIF的發(fā)生與進展；目前發(fā)現(xiàn)蛋白尿、TGF-β1、肝細胞生長因子(HCG)、腎組織局部腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)、核因子(NF)-κB等因素與RIF有關〔3,4〕。本研究前期的研究已證實整合素連接激酶(ILK)、E-鈣黏素、轉化生長因子(TGF)-β1等與RIF密切相關，且活性維生素D3可以通過調節(jié)ILK、E-鈣黏素、TGF-β1等因子改善RIF，但是活性維生素D3改善RIF的具體機制尚不明確MAPK是真核生物細胞主要信號轉導通路之一，P38MAPK屬于MAPK的亞族，目前P38MAPK同型異構體已知的有6種：P38α1/α2，P38γ和P38δ，P38β1/β2，在全身組織細胞中廣泛表達〔5〕。當細胞受到外界刺激后(如促炎因子、高滲、低氧、紫外線、放射線、熱休克及其他應激反應)MAPK激酶 (MAPKKK)磷酸化，并將磷酸化基團向下游傳遞，繼而MAPK激酶(MAPKK)，活化的MAPKK通過P-MAPK的蘇氨酸(T)和酪氨酸(Y)位點，活化MAPK，將細胞外刺激信號傳遞給胞核〔6〕；有學者證實：P38MAPK活化可以加速TEMT進程〔6〕，本研究團隊前期研究已在人類腎小管上皮細胞中證實高糖可促進P38MAPK活化，增加p-P38MAPK蛋白表達，促進TEMT進程，而QLT0267可抑制P38MAPK的活化，減少磷酸化P38MAPK蛋白表達，延緩TEMT進程〔7〕。

本研究結果與前期動物模型試驗結果一致；Western印跡法觀察P38MAPK及p-P38MAPK蛋白表達量顯示：UUO模型組在第3天既出現(xiàn)磷酸化P38MAPK蛋白表達增加，并隨時間的延長、腎間質病理損害程度的加重而表達增加，磷酸化P38MAPK蛋白的表達與病理積分呈正相關，分析其原因可能是UUO模型建立以后，隨著梗阻時間延續(xù)，炎細胞浸潤明顯，炎癥介質的釋放增加，磷酸化P38MAPK蛋白表達開始增加〔8〕，而P38MAPK的活化可以促進TEMT〔6〕，加速RIF的發(fā)生，這與Luo等〔9〕的研究一致；本研究結果提示：活性維生素D3干預后P38MAPK活化受到抑制，磷酸化P38MAPK蛋白水平降低，分析可能原因：①活性維生素D3可抑制UUO模型腎臟炎癥反應，從而減輕P38MAPK的激活。②ILK是MAPKs家族上游蛋白，本研究團隊前期試驗已證明活性維生素D3可抑制UUO大鼠模型腎組織中ILK的表達，而ILK作為P38MAPK的上游信號分子，P38MAPK活化受到抑制可能與ILK表達下調有關。

綜上，活性維生素D3可以間接或直接下調UUO大鼠腎組織p-P38MAPK蛋白水平，抑制P38MAPK的活化,延緩EMT發(fā)生，從而減輕RIF而保護腎臟功能，為防治RIF提供了新的研究方向和治療靶點，本團隊將會繼續(xù)就活性維生素D3對TEMT及RIF保護作用做進一步研究。