張程 吳姍姍 呂丹 張婷婷 張藝凡

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，遼寧 沈陽 110032)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種常見的累及多臟器的慢性炎癥性自身免疫病，臨床表現(xiàn)復(fù)雜〔1〕，發(fā)病率逐年增高，且女性比男性多發(fā)〔2〕。SLE發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，受多重因素影響，包括基因、環(huán)境和趨化因子等，趨化因子受體在SLE炎癥反應(yīng)中的作用成為近年來熱門的課題〔3〕。

趨化因子是由多種細(xì)胞分泌的具有可引起白細(xì)胞趨化特性的細(xì)胞因子，參與多種免疫性疾病及炎癥性疾病的致病過程。趨化因子根據(jù)其蛋白中半胱氨酸殘基的排列，可分為CXC型、CC型、C型和CX3C型四種〔4〕，CC型是炎性細(xì)胞典型的趨化因子〔5〕。趨化因子受體為7次跨膜G蛋白耦聯(lián)受體蛋白，表達(dá)于免疫細(xì)胞表面〔6〕，根據(jù)結(jié)合趨化因子不同分為CXC型和CC型〔7〕。CCR5是CC類趨化因子的受體，通過調(diào)控T細(xì)胞和單核細(xì)胞來參與免疫反應(yīng)〔8〕。CCR5編碼基因位于人類3P21染色體短臂上，已發(fā)現(xiàn)該編碼區(qū)出現(xiàn)缺失32 bp的基因型(CCR5Δ32/rs333)，該缺失導(dǎo)致純合子個(gè)體表面無CCR5的表達(dá)，雜合子個(gè)體CCR5表達(dá)量下降〔9〕。

目前已有研究支持CCR5Δ32基因型個(gè)體對人類免疫缺陷病毒(HIV)-1耐受，其缺失的CCR5可以抵抗HIV對宿主細(xì)胞的攻擊〔10〕，然而該基因型在自身免疫疾病中的作用仍存在爭議。Pokorny等〔11，12〕研究認(rèn)為CCR5Δ32可以降低類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的易感性，而Samson等〔9〕持反對意見。CCR5Δ32基因型對多發(fā)性硬化癥的影響也同樣存在爭議〔13，14〕。目前認(rèn)為CCR5Δ32基因型對SLE的影響根據(jù)人種、地域而發(fā)生變化〔5，15，16〕，但并沒有針對老年人群中該指標(biāo)與SLE關(guān)系的研究。本研究通過研究遼寧地區(qū)老年人群中CCR5基因多態(tài)性、SLE活動度相關(guān)檢測指標(biāo)，與對照組比較，來明確老年人群中SLE易感性及SLE活動度與CCR5基因多態(tài)性的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1研究對象 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院2017年1月至2018年9月門診及住院SLE患者500例，其中女258例，男242例，年齡60～66歲，平均(63.2±2.5)歲。SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)采用美國風(fēng)濕協(xié)會SLE診斷標(biāo)準(zhǔn)(1982年制定)，符合該標(biāo)準(zhǔn)中4條者可確診。對照組從遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院遼寧省體檢正常老年人中抽取500例，其中女252例，男248例，平均年齡(64.5±3.8)歲。兩組性別和年齡均無顯著差異(P>0.05)。

1.2材料 PCR擴(kuò)增試劑盒(天根生化科技有限公司)，抗核抗體(ANA)譜及dsDNA抗體檢測試劑盒(歐盟)，瓊脂糖凝膠電泳采用伯樂電泳槽。

1.3方法 ①臨床指標(biāo)檢測：兩組人群分別進(jìn)行以下項(xiàng)目檢查：基礎(chǔ)檢查包括發(fā)病年齡、身高、體重、體重指數(shù)(BMI)。SLE活動度評價(jià)指標(biāo)(參照SLEDAI標(biāo)準(zhǔn))包括血清C3、C4濃度(邁克生物，四川)，ANA滴度(>1∶100為陽性)(歐蒙，北京)，雙鏈DNA抗體(歐蒙，北京)，外周血白細(xì)胞總數(shù)。②CCR5Δ32基因多態(tài)性檢測：從新鮮外周血提取基因組DNA(天根DNA提取試劑盒)，PCR法擴(kuò)增CCR5基因(天根PCR擴(kuò)增試劑盒，引物正義鏈：ACCAGATCTCAAAAAGAA，反義鏈：CATGATGGTGAAGATAAGCTTCA)，25 μl反應(yīng)體系中含有2.5 μmol/L dNTP 2 μl，2.5 μmol/L Mg2+1.5 μl，2.5 μmol/L正、反向引物各2.5 μl，5 U/μl Taq 0.25 μl，10 ng/μl模板10 μl，10×緩沖液2.5 μl，去離子水3.75 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，目的片段為225 bp(野生株)和193 bp(突變株)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS11.5軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)、Hardy-Weinberg檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1SLE組臨床檢測指標(biāo)結(jié)果 SLE組≤SLEDAI 3條人數(shù)占57.4%，C3、C4濃度均值均在正常范圍內(nèi)，ANA滴度陽性61.6%，抗dsDNA抗體陽性66.0%。

2.2CCR5基因多態(tài)性結(jié)果判讀 通過電泳鑒定可以直觀分析出，CCR5為野生型時(shí)，產(chǎn)物片段為225 bp；若CCR5基因發(fā)生32堿基缺失時(shí)，產(chǎn)物片段為193 bp，當(dāng)兩個(gè)片段同時(shí)出現(xiàn)時(shí)即為雜合子(CCR5/CCR5Δ32)，見圖1。樣本中均無CCR5Δ32/CCR5Δ32純合子出現(xiàn)。CCR5基因型及等位基因在兩組研究對象中符合Hardy-Weinberg平衡(χ2=1.76，P>0.05)，CCR5的基因頻率在兩組研究對象中顯著高于CCR5Δ32。見表1。

2.3SLE患者CCR5/CCR5基因型組與CCR5/CCR5Δ32基因型組臨床檢測指標(biāo)比較 將SLE組按基因型的不同分成CCR5/CCR5組與CCR5/CCR5Δ32組。兩基因小組C3、C4、ANA滴度均無差異，CCR5/CCR5Δ32組發(fā)病年齡低于CCR5/CCR5組，但無顯著差異。突變組抗dsDNA抗體陽性率高于野生組(P<0.05)。見表2。

M為marker，除2號為雜合子(CCR5/CCR5Δ32)外，其余均為野生型純合子(CCR5/CCR5)

表1 兩組CCR5基因多態(tài)性的差異〔n(%),n=500〕

表2 SLE患者CCR5/CCR5基因型組與CCR5/CCR5Δ32基因型組臨床檢測指標(biāo)比較

3 討 論

CCR5是CC類趨化因子受體，可結(jié)合RANTES、MIP-1α等結(jié)合參與炎癥反應(yīng)，介導(dǎo)SLE等自身免疫性疾病對各器官組織的攻擊。CCR5Δ32是CCR5的突變株，缺失32個(gè)堿基使編碼CCR5的基因功能喪失，而成為無效受體，從而無法完成炎癥反應(yīng)，是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制〔17〕。全球統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，CCR5Δ32等位基因頻率為4.18%，各個(gè)國家的數(shù)據(jù)有較大區(qū)別，歐洲其基因頻率為5%～16%，而美洲、日本、中國的頻率較低〔18〕。楊仕貴等〔15，19〕統(tǒng)計(jì)安徽省漢族人群CCR5Δ32等位基因頻率為0.63%。

Schauren等〔15〕發(fā)現(xiàn)CCR5Δ32基因頻率存在的差異不僅受人種影響外，還與SLE患者疾病進(jìn)展程度、發(fā)病年齡相關(guān)，對巴西南部SLE女性患者檢查發(fā)現(xiàn)，有CCR5Δ32基因存在的患者其發(fā)病年齡較未突變患者更早〔20〕，從而證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)CCR5Δ32突變組比未突變組的發(fā)病年齡較低，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不除外人種基因突變頻率低的影響，也與患者納入隊(duì)列時(shí)的病情、樣本量不夠大等因素有關(guān)。

有研究發(fā)現(xiàn)，SLE發(fā)病年齡越早，損傷程度越大，受累器官越多，以腎臟損傷最為明顯，且ANA及抗dsDNA抗體陽性率越高〔21〕。本研究結(jié)果可能由于CCR5Δ32的突變提高了ds-DNA抗體陽性率，而ds-DNA抗體陽性率的提高是否影響SLE的進(jìn)展及受累器官，特別是腎臟損傷的嚴(yán)重程度，還需要進(jìn)一步通過對腎臟相關(guān)檢查與dsDNA抗體的聯(lián)合分析來深入研究。

綜上，遼寧老年人群中主要以CCR5野生基因型為主，CCR5Δ32突變頻率較低。CCR5Δ32突變可以通過提高抗dsDNA抗體的陽性率來影響SLE。