程松 郭婧瀾

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川 瀘州 646000)

原發(fā)性肝癌(HCC)是常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，世界標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率和死亡率分別為10.1/10萬、9.5/10萬〔1〕。我國是肝癌大國，肝癌的發(fā)病率和死亡率均高于世界平均水平。目前肝癌尚無早期診斷的敏感方法，發(fā)現(xiàn)時多為肝癌晚期。此外，雖然近年來手術(shù)治療、化療及免疫治療等均取得了較大進(jìn)展，但HCC患者的術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率仍然較高〔2〕。因而需要深入研究HCC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為診斷和治療提供新的生物學(xué)標(biāo)志。微小RNA(microRNAs)是小內(nèi)源性非編碼RNA，有18～25個核苷酸，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程的調(diào)控〔3〕，目前miRbase數(shù)據(jù)庫中的223個種屬中鑒定出28 645個miRNA前體，35 828個成熟miRNA。miRNA可通過影響靶基因表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)途徑，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等生物學(xué)過程〔4〕。有研究表明與癌旁組織相比，肝癌組織中miR-21及miR-200b表達(dá)升高，miR-148b及miR-200a表達(dá)降低，高水平表達(dá)miR-21、miR-200b，低表達(dá)miR-148b、miR-200a是患者預(yù)后不良的重要標(biāo)志〔5～7〕。本研究旨通過研究HCC患者血清中miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b的表達(dá)，分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系，研究其臨床診斷意義。

1 資料與方法

1.1一般臨床資料 2013年4月至2015年4月于西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院診治的93例HCC患者(病例組)的血清標(biāo)本，并收集臨床病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：①HCC的診斷符合2001年9月中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會廣州制定的HCC臨床診斷和分期標(biāo)準(zhǔn)〔8〕。②所有HCC患者為初次診治，手術(shù)前未接受過化療、放療等治療。③患者肝腎功能正常，水電解質(zhì)酸堿平衡。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床病歷資料不完整。②患者合并其他惡性腫瘤。③合并嚴(yán)重感染性疾病。年齡33～71歲，平均(41.5±9.7)歲；伴慢性乙型肝炎61例，無慢性乙型肝炎32例。選取同期西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的48例肝臟良性病變患者作為良性組，其中25例為肝血管瘤，14例為肝囊腫，9例肝膿腫。其中男28例，女20例，年齡34～75歲，平均(38.2±7.1)歲。48例慢性肝病患者作為慢性肝病組，其中乙型慢性肝炎20例，肝炎后肝硬化13例，酒精性肝硬化11例，丙型病毒性肝炎4例。該組男28例，女20例，年齡30～74歲，平均(39.5±8.4)歲。以50例同期健康體檢的正常人血清標(biāo)本作為對照組，其中男29例，女21例，年齡32～70歲，平均(37.2±7.7)歲。各組性別、年齡無顯著差異(均P>0.05)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過，患者及家屬均知情同意并已簽署知情同意書。

1.2檢測方法 所有研究對象入院后第二日清晨空腹采集靜脈血5 ml，室溫下靜置1 h后，1 500 r/min，離心半徑10 cm，離心10 min。取上清置于離心管中并保存在-80℃冰箱中待測。采用全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(RocheE710)檢測所有研究對象血清中甲胎蛋白(AFP)含量，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作(購自羅氏上海有限公司)，AFP正常值0.0～8.1 μg/L。按照血清總RNA提取試劑盒(QIAGEN，美國)提取血清中總RNA，應(yīng)用NanoDrropND-1000測定RNA純度。將提取出的RNA樣品置于-40℃冰箱保存。采用miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(QIAGEN，美國)將miRNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系中包括0.5 μg總RNA，4 μl逆轉(zhuǎn)錄混合反應(yīng)液，1 μl反轉(zhuǎn)錄酶混合液。合成cDNA后保存于-20℃冰箱。應(yīng)用SYBR Green PCR試劑盒(QIAGEN，美國)在MX3000P Real-time PCR system(Stratagen,美國)上進(jìn)行PCR反應(yīng)。以U6作為內(nèi)參基因，引物序列如下見表1。反應(yīng)條件如下：95℃ 10 s，90℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。用相對Ct值方法分析數(shù)據(jù)，目的基因的表達(dá)相對于內(nèi)參基因U6的比值為2-ΔΔCt，計(jì)算miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b的相對定量表達(dá)水平。

表1 實(shí)時定量PCR引物序列

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、χ2檢驗(yàn)及受試者工作特征(ROC)曲線。

2 結(jié) 果

2.1各組血清中miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b的表達(dá)比較 HCC組血清中miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b表達(dá)分別與肝良性病變組、慢性肝病組及正常對照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。HCC組血清miR-21與miR-200b表達(dá)顯著高于良性組(t=2.869、2.524，P=0.007、0.009)、慢性肝病組(t=2.904、2.735，P=0.002、0.003)及對照組(t=3.269、2.897，P=0.001、0.004)，而HCC組miR-200a與miR-148b表達(dá)顯著低于良性組(t=2.230、2.012，P=0.011、0.011)、慢性肝病組(t=2.869、2.524，P=0.007、0.000)和對照組(t=2.751、2.254，P=0.007、0.026)。見表2。

表2 各組血清中miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b的表達(dá)比較

與HCC組比較：1)P<0.05

2.2HCC組血清miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b與臨床病理特征之間的關(guān)系 HCC組血清miR-21與miR-200b表達(dá)與病理分期、病理分級及腫瘤直徑有關(guān)(P<0.05,P<0.01)。血清miR-200a與miR-148b表達(dá)與病理分期、病理分級有關(guān)(P<0.05，P<0.01)，見表3。

表3 血清四種miRNA與HCC臨床特征之間的關(guān)系

2.3檢測血清miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b在診斷HCC中的診斷價值 miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b的ROC曲線下面積(AUC)分別為0.821、0.668、0.772、0.734，而四項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷的AUC為0.922，AFP為0.849，見表4，圖1。miR-148b 的診斷準(zhǔn)確性較低(0.5

表4 miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b及聯(lián)合診斷的診斷價值

圖1 miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b、四項(xiàng)聯(lián)合診斷及AFP的ROC曲線

3 討 論

近年來研究表明，細(xì)胞內(nèi)非編碼的miRNA調(diào)節(jié)基因表達(dá)，影響細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如磷脂酰肌醇3激酶/絲氨酸/蘇氨酸激酶(PI3K/AKT)通路、notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等，促進(jìn)細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過程〔9〕。miRNA可以與靶基因3′端非偏碼區(qū)(UTR)的相應(yīng)靶點(diǎn)結(jié)合，改變靶基因mRNA的生物穩(wěn)定性，誘導(dǎo)mRNA降解或抑制靶基因mRNA的翻譯過程，參與調(diào)控腫瘤、炎癥、免疫反應(yīng)等多種病理生理過程。腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，伴有miRNA表達(dá)異常，包括表達(dá)上調(diào)或下調(diào)，發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。近年來研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸直腸癌〔10〕、神經(jīng)膠質(zhì)瘤〔11〕等腫瘤中均存在多種miRNA異常表達(dá)的現(xiàn)象。本研究結(jié)果與以往研究報道一致〔12〕。HCC中miR-21的作用機(jī)制是其靶向重要的腫瘤抑制基因，如磷酸酶和張力蛋白同源物(PTEN)，Kazal基序逆向誘導(dǎo)富含半胱氨酸蛋白(RECK)和組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)3等。如RECK可編碼調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)9的酶，在某些惡性腫瘤中下調(diào)表達(dá)時，腫瘤細(xì)胞侵襲性增強(qiáng)〔13〕。本研究中，HCC患者血清miR-148b表達(dá)顯著低于肝良性病變組、慢性肝病組及正常對照組。其機(jī)制可能與miR-148b對腫瘤細(xì)胞增殖信號抑制作用降低有關(guān)。有研究表明，miR-148b可影響Met、Wnt1、SMAD2等基因的表達(dá)，影響Met/snail和TGFβ-SMAD2信號通路的傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)等過程〔14〕。

miR-200家族分為兩個亞家族，miR-200a亞家族包括miR-200a和miR-141，定位于染色體1p36，miR-200b亞家族包括miR-200b，miR-200c，和miR-429，定位于染色體12p13。MiR-200家族的5個成員是EMT的主要調(diào)節(jié)因子〔15〕。miR-200a表達(dá)下調(diào)或缺失后，下游靶基因Rho激酶(ROCK)2表達(dá)上調(diào)，Rho/ROCK信號傳導(dǎo)通路的活化可促進(jìn)肌動蛋白收縮，應(yīng)力纖維的形成和黏著斑的轉(zhuǎn)換，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移〔16〕。Rho家族中的小鳥嘌呤三核苷酸磷酸(GTP)酶RhoA及其下游效應(yīng)子ROCK2的表達(dá)增加進(jìn)一步上調(diào)HCC中miR-200b的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的作用。在生理和病理?xiàng)l件下，miR-200亞家族之間是否存在功能性交叉對話，值得進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明檢測血清中的miR-21、miR-148b、miR-200a、miR-200b的表達(dá)水平，可能有助于判斷腫瘤分期分化。其原因可能是四種miRNA是調(diào)節(jié)HCC發(fā)生發(fā)展過程中的不同信號通路中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，如miR-21參與抑癌基因的調(diào)控、miR-148b參與細(xì)胞增殖信號調(diào)控，而miR-200a和miR-200b參與腫瘤細(xì)胞EMT過程，關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的改變將影響腫瘤的增殖、凋亡及遷移等惡性生物學(xué)行為。此外，動態(tài)檢測循環(huán)miRNA可以評估患者術(shù)后狀態(tài)，包括腫瘤的復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移〔17〕。本研究結(jié)果表明，四項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合診斷的診斷準(zhǔn)確性較高，聯(lián)合診斷的敏感性和特異性均高于任一單一指標(biāo)，因而有可能成為臨床診斷的新的分子標(biāo)志物。然而，本研究樣本例數(shù)較少，并且miRNA表達(dá)具有時間和空間特異性，聯(lián)合檢測上述四種miRNA在原發(fā)性肝癌的診斷是否穩(wěn)定并且可重復(fù)，有待進(jìn)一步多中心大樣本研究。