（南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二醫(yī)院 肝膽外科，江蘇 無錫 214001）

原發(fā)性肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是世界第5大常見的惡性腫瘤，中國患者約占55%[1]。手術(shù)是治療HCC的主要方式，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高，其5年生存率仍較低[2]。microRNA（miRNA）是一群內(nèi)源性非編碼小分子RNA，通過與靶基因mRNA的3'非編碼區(qū)（3'UTR）結(jié)合，導(dǎo)致靶基因mRNA 降解或翻譯受阻，以參與靶基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)[3]。有研究表明，miR-1301在包括HCC 內(nèi)的多種腫瘤中表達(dá)下調(diào)，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起到抑制作 用[4-7]，但其與肝癌患者臨床預(yù)后關(guān)系尚不明確。本研究通過檢測HCC組織中miR-1301的表達(dá)水平，分析其與患者臨床數(shù)據(jù)及預(yù)后的關(guān)系，可能為HCC 患者預(yù)后評估提供新的分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2011年1月—2014年1月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫第二醫(yī)院行HCC根治手術(shù)的60例患者臨床資料、組織樣本及隨訪資料。根據(jù)miR-1301相對表達(dá)量數(shù)值的中位數(shù)截點(diǎn)，將患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，每組30例。所有癌組織及相應(yīng)癌旁組織（距腫瘤邊緣＞2 cm的正常肝臟組織）均與液氮速凍并保存于-80℃冰箱。患者術(shù)后第1、3及6個月復(fù)查CT、血清甲胎蛋白（alpha-fetal protein,AFP），之后每半年復(fù)查CT及AFP，所有考慮復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的患者有CT、超聲造影、AFP或穿刺活檢病理等其中2或3項(xiàng)診斷，患者隨訪時間截至2019年1月。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者及其家屬知情同意。

1.2 方法

所有肝癌組織及癌旁組織的RNA 通過Trizol（美國Invitrogen公司）提取，具體步驟參照試劑盒說明書。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Applied Biosystems公司）將RNA 逆轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)DNA，然后應(yīng)用miR 特異性TaqMan 探針和TaqMan Universal PCR Master Mix（美國ABI公司）進(jìn)行miR-1301的實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR）檢測，反應(yīng)在StepOne Plus 探測系統(tǒng)（美國ABI公司）上進(jìn)行，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，60℃退火1 min，60℃延伸1 min，共40個循環(huán)。內(nèi)參為RNU6B，每個反應(yīng)設(shè)置3個復(fù)孔，miR-1301的相對表達(dá)量用2-??Ct法計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)；用Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗(yàn)，影響因素的分析用多因素Cox 風(fēng)險比例模型，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-1301在肝癌組織中表達(dá)降低

癌組織組與癌旁組織組miR-1301相對表達(dá)量分別為（26.900±8.994）和（41.183±10.759），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=7.824，P=0.000），癌組織組低于癌旁組織組。見圖1。

圖1 HCC 患者癌組織與癌旁組織中miR-1301相對表達(dá)量比較（±s）

2.2 miR-1301相對表達(dá)量與患者臨床病理特征的關(guān)系

miR-1301相對表達(dá)量在患者性別、年齡、乙型肝炎病毒、腫瘤部位、AFP水平及Child分級比較，經(jīng)χ2檢驗(yàn)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；而腫瘤直徑、臨床分期及有無脈管癌栓比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 不同影響因素的miR-1301的高表達(dá)率比較

續(xù)表1

2.3 miR-1301表達(dá)下調(diào)提示肝癌患者不良預(yù)后

為分析miR-1301表達(dá)與患者臨床預(yù)后的關(guān)系，繪制miR-1301 低表達(dá)組和高表達(dá)組Kaplan-Meier曲線。miR-1301 低表達(dá)組總生存為23.33%（7/30），miR-1301 高表達(dá)組總生存為50.00%（15/30），經(jīng)Log-rank χ2檢驗(yàn)，結(jié)果顯示miR-1301 低表達(dá)組肝癌患者總生存率低于高表達(dá)組（χ2=0.032，P=0.021）（見 圖2）。單因素分析顯示，腫瘤直徑、脈管癌栓、臨床分期及miR-1301表達(dá)量與患者不良預(yù)后有關(guān)（P＜0.05）。多因素Cox 回歸模型分析顯示，腫瘤直徑、脈管癌栓臨床分期、miR-1301 低表達(dá)是影響肝癌預(yù)后的獨(dú)立因素（P＜0.05）。見表2。

圖2 HCC組織中miR-1301表達(dá)與患者總生存率的關(guān)系

表2 肝癌患者術(shù)后預(yù)后影響因素的單因素及多因素分析參數(shù)

3 討論

miRNA是一類長約23 個核苷酸序列的非編碼小RNA，對幾乎所有腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程扮演重要角色，例如HCC，其參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移等生物過程[8]。近年來在腫瘤預(yù)后標(biāo)志物研究領(lǐng)域，miRNA 已成為新的研究熱點(diǎn)，已發(fā)現(xiàn)多個miRNA與肝癌的臨床預(yù)后相關(guān)，其具有成為肝癌預(yù)后分子標(biāo)志物的潛能[9-12]。

越來越多的研究表明，miR-1301 對包括HCC 內(nèi)的多種腫瘤表達(dá)下調(diào)，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起到抑制作用，提示患者的不良預(yù)后。YANG 等[4]發(fā)現(xiàn)，miR-1301 在肝癌中表達(dá)下調(diào)，靶向調(diào)控BCL9 mRNA，通過Wnt/β-catenin 信號通路抑制肝癌的侵襲、轉(zhuǎn)移及血管形成。ZHI 等[6]發(fā)現(xiàn)，miR-1301 通過靶向調(diào)控N-Ras 抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖，此外miR-1301 的表達(dá)下調(diào)還與膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后相關(guān)[12]。YAO 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-1301 可通過介導(dǎo)RanGAP1 下調(diào)，增加慢性粒細(xì)胞白血病患者伊馬替尼的療效。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，miR-1301 在肝癌組織中表達(dá)下調(diào)，首次發(fā)現(xiàn)miR-1301 表達(dá)水平與肝癌患者的腫瘤直徑、臨床分期及有無脈管癌栓相關(guān)，Kaplan-Meier 生存分析結(jié)果提示，miR-1301 高表達(dá)組總生存率高于低表達(dá)組，進(jìn)一步單因素及多因素分析提示，miR-1301 表達(dá)量是影響肝癌預(yù)后的獨(dú)立因素，可能為肝癌的預(yù)后評估提供新的途徑。

綜上所述，miR-1301 在多種腫瘤中扮演抑癌基因作用，miR-1301 的表達(dá)下調(diào)促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，提示患者的不良預(yù)后。一種miRNA 可調(diào)控不同的靶基因從而發(fā)揮不同的生理功能。進(jìn)一步研究miR-1301 在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的具體分子機(jī)制，可能為肝癌的診斷、治療及預(yù)后評估提供新的分子標(biāo)志物。