張躍偉，孫鎖柱，張丹，謝靜，張蓉，李長(zhǎng)政

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)火箭軍總醫(yī)院 研究生培養(yǎng)基地，遼寧 錦州121001；中國(guó)人民解放軍火箭軍特色醫(yī)學(xué)中心 2.病理科，3.消化科，4.中醫(yī)科，北京 100088）

近年來(lái)，隨著結(jié)直腸和婦科腫瘤放療患者的增多，放射性腸炎的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢(shì)。放射性腸炎發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及細(xì)胞凋亡、微血管損傷、炎癥介質(zhì)表達(dá)上調(diào)、免疫屏障破壞及腸道菌群失調(diào)等多個(gè)方面，其中微血管損傷是重要機(jī)制之一[1-2]。內(nèi)鏡下放射性腸炎常呈黏膜下血管網(wǎng)減少與周?chē)芗叵嚅g分布等特征性表現(xiàn)，可能與輻射后微血管損傷、數(shù)目減少、密度下降，黏膜下纖維化，殘留或新生血管異常生長(zhǎng)等因素有關(guān)。但典型改變發(fā)生時(shí)間較晚，目前對(duì)急性期微血管損傷機(jī)制的研究相對(duì)較 少[3-4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察輻射后第1、7及14天不同時(shí)間點(diǎn)輻射組和干預(yù)組小鼠小腸組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）通路mRNA表達(dá)變化，探討放射性腸炎早期微血管相關(guān)基因在微血管損傷發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)意義及氨磷汀對(duì)微血管的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)健康C57BL/10J小鼠84只，3個(gè)月齡，雌雄各42只，雌鼠體重（20±2）g，雄鼠體重（28±2）g，由南京大學(xué)生物醫(yī)藥研究院培育[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（蘇）2018-0008]。將小鼠隨機(jī)分成對(duì)照組（12只）、輻射組（36只）、干預(yù)組（36只）。對(duì)照組未輻射，輻射組和干預(yù)組分別于輻射后第1、7和14天處死12只小鼠。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 固定組織RNA 提取試劑盒和UltraSYBR Mixture 試劑盒（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（美國(guó)賽默飛世爾公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 輻射60Co-γ 輻照裝置由北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院提供，北京伽瑪高新有限公司生產(chǎn)（型號(hào)：GM-11-03-A），對(duì)輻射組小鼠進(jìn)行一次性6 Gy 輻射，小鼠籠距輻射源≤30 cm，劑量率1.00 Gy/min，總時(shí)長(zhǎng)6 min。干預(yù)組小鼠輻射前30 min 腹腔注射氨磷汀，按人體給藥劑量換算成小鼠給藥量為200 mg/kg。

1.2.2 標(biāo)本制作分別于輻射后第1、7及14天采用頸椎脫臼法處死小鼠，取出小腸，用磷酸鹽緩沖液沖洗至無(wú)糞便殘留，剪切分段，分別置于10%甲醛中固定，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病理切片 常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、組織切片及HE 染色。

1.2.4 qRT-PCR 參照固定組織RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用兩步法進(jìn)行qRT-PCR，GAPDH 為內(nèi)參，引物由北京天一輝遠(yuǎn)科技有限公司提供。見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物列表

2 結(jié)果

2.1 病理改變

光學(xué)顯微鏡下觀察，對(duì)照組小鼠小腸黏膜下微血管分布規(guī)律、結(jié)構(gòu)完整（見(jiàn)圖1A）。輻射組與干預(yù)組第1天均可見(jiàn)微血管充血、擴(kuò)張及紅細(xì)胞溢出等改變，且兩組無(wú)差異（見(jiàn)圖1B）；輻射組第7天黏膜下層微血管數(shù)量減少，血管壁變薄、破壞，干預(yù)組剩余血管數(shù)量多于輻射組，且結(jié)構(gòu)相對(duì)完整（見(jiàn)圖1C、D）；輻射組第14天黏膜下層微血管進(jìn)一步減少，階段性消失，結(jié)構(gòu)完整的微血管罕見(jiàn)，黏膜、黏膜下結(jié)構(gòu)紊亂及細(xì)胞數(shù)目減少，干預(yù)組無(wú)微血管階段性消失現(xiàn)象，仍可見(jiàn)結(jié)構(gòu)完整的微血管（見(jiàn)圖1E、F）。

圖1 各組小鼠小腸黏膜病理切片（HE 染色×200）

2.2 qRT-PCR 擴(kuò)增曲線和熔解曲線

各組VEGF、bFGF、PI3K及PKB基因不同CT值的擴(kuò)增曲線平行性良好，其傾斜程度基本一致，說(shuō)明目的基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率一致。上述各目的基因和內(nèi)參基因熔解曲線均在對(duì)應(yīng)熔解溫度上形成單峰，說(shuō)明產(chǎn)物特異性良好。在對(duì)照組和各不同時(shí)間點(diǎn)輻射組、干預(yù)組中分別選取一條代表性擴(kuò)增曲線和熔解曲線（見(jiàn)圖2 ～9）。

2.3 對(duì)照組與輻射組VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

對(duì)照組與輻射組第1、7及14天小鼠小腸組織中VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，輻射組第1和7天VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量升高（P＜0.05），且輻射組 第14天VEGF、bFGF mRNA相對(duì)表達(dá)量仍升高（P＜0.05）。對(duì)照組與輻射組第14天PI3K、PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表2和圖10。

2.4 對(duì)照組與干預(yù)組VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

圖2 輻射組VEGF基因qRT-PCR 擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖3 輻射組bFGF基因qRT-PCR 擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖4 輻射組PI3K基因qRT-PCR 擴(kuò)增曲線和熔解曲線

對(duì)照組和干預(yù)組第1、7及14天小鼠小腸組織中VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，干預(yù)組第1天VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量均升高（P＜0.05）；對(duì)照組與干預(yù)組第7和14天VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表3和圖11。

2.5 輻射組和干預(yù)組各時(shí)VEGF、bFGF、PI3K、PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較

圖5 輻射組PKB基因qRT-PCR 擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖6 干預(yù)組VEGF基因qRT-PCR 擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖7 干預(yù)組bFGF基因qRT-PCR 擴(kuò)增曲線和熔解曲線

輻射組與干預(yù)組第1、7及14天VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量有差別（F=75.66，P=0.000）；②兩組的VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量有差別（F=66.689，P=0.000），干預(yù)組較輻射組低；③兩組VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)有差別（F=16.975，P=0.000）。見(jiàn)表4。

輻射組與干預(yù)組第1、7及14天bFGF mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的bFGF mRNA相對(duì)表達(dá)量有差別（F=75.289，P=0.000）；②兩組的bFGF mRNA相對(duì)表達(dá)量有差別（F=109.134，P=0.000），干預(yù)組較輻射組低；③兩組的bFGF mRNA相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)有差別（F=13.322，P=0.000）。見(jiàn)表5。

圖8 干預(yù)組PI3K基因qRT-PCR 擴(kuò)增曲線和熔解曲線

圖9 干預(yù)組PKB基因qRT-PCR 擴(kuò)增曲線和熔解曲線

表2 對(duì)照組與輻射組VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n =12，±s）

表2 對(duì)照組與輻射組VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n =12，±s）

注：?與對(duì)照組比較，P ＜0.05。

組別 VEGF mRNA bFGF mRNA PI3K mRNA PKB mRNA對(duì)照組 1.00±0.01 1.00±0.01 1.00±0.01 1.00±0.01輻射組第1天 13.07±1.09? 11.70±0.80? 13.02±0.93? 10.70±0.78?輻射組第7天 6.11±0.78? 6.45±0.95? 5.57±0.78? 5.96±0.43?輻射組第14天 2.39±0.30? 2.36±0.33? 1.22±0.14 1.37±0.22 F 值 35.358 27.311 55.597 60.286 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖10 對(duì)照組與輻射組VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n =12，±s）

輻射組與干預(yù)組第1、7及14天的PI3K mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的PI3K mRNA相對(duì)表達(dá)量有差別（F=79.914，P=0.000）；②兩組的PI3K mRNA相對(duì)表達(dá)量有差別（F=57.871，P=0.000），干預(yù)組較輻射組低；③兩組的PI3K mRNA相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)有差別（F=9.597，P=0.001）。見(jiàn)表6。

輻射組與干預(yù)組第1、7及14天的PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)的PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量有差別（F=84.241，P=0.000）；②輻射組與干預(yù)組的PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量有差別（F=103.748，P=0.000），干預(yù)組較輻射組低；③兩組的PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)有差別（F=33.951，P=0.001）。見(jiàn)表7。

表3 對(duì)照組與干預(yù)組VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n =12，±s）

表3 對(duì)照組與干預(yù)組VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n =12，±s）

注：?與對(duì)照組比較，P ＜0.05。

組別 VEGF mRNA bFGF mRNA PI3K mRNA PKB mRNA對(duì)照組 1.00±0.01 1.00±0.01 1.00±0.01 1.00±0.01干預(yù)組第1天 5.16±0.58? 4.92±0.43? 6.80±0.85? 3.43±0.39? 干預(yù)組第7天 1.18±0.11 1.37±0.18 1.16±0.13 1.70±0.24干預(yù)組第14天 1.14±0.15 1.13±0.17 1.32±0.19 1.16±0.16 F 值 25.257 37.629 28.630 12.172 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖11 對(duì)照組與干預(yù)組VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n =12，±s）

表4 輻射組和干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量 比較（n =12，±s）

表4 輻射組和干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)VEGF mRNA相對(duì)表達(dá)量 比較（n =12，±s）

組別 第1天 第7天 第14天輻射組 13.07±1.09 6.11±0.78 2.39±0.30干預(yù)組 5.16±0.58 1.18±0.11 1.14±0.15

表5 輻射組和干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)bFGF mRNA相對(duì)表達(dá)量 比較（n =12，±s）

表5 輻射組和干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)bFGF mRNA相對(duì)表達(dá)量 比較（n =12，±s）

組別 第1天 第7天 第14天輻射組 11.70±0.80 6.45±0.95 2.36±0.33干預(yù)組 4.92±0.43 1.37±0.18 1.13±0.17

表6 輻射組和干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)PI3K mRNA相對(duì)表達(dá)量 比較（n =12，±s）

表6 輻射組和干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)PI3K mRNA相對(duì)表達(dá)量 比較（n =12，±s）

組別 第1天 第7天 第14天輻射組 13.02±0.93 5.57±0.78 1.22±0.14干預(yù)組 6.80±0.85 1.16±0.13 1.32±0.19

表7 輻射組和干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量 比較（n =12，±s）

表7 輻射組和干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)PKB mRNA相對(duì)表達(dá)量 比較（n =12，±s）

組別 第1天 第7天 第14天輻射組 10.70±0.78 5.96±0.43 1.37±0.22干預(yù)組 3.43±0.39 1.70±0.24 1.16±0.16

3 討論

VEGF是最有效的血管生成生長(zhǎng)因子之一，具有增加血管通透性，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖及血管形成等作用[5]。有研究表明，血管在發(fā)育過(guò)程中，尖端細(xì)胞可感知VEGF的梯度，導(dǎo)致絲狀偽足形成，并向VEGF 梯度遷移[6]。血管生成對(duì)于傷口愈合、組織再生及炎癥性疾病至關(guān)重要，也在輻射損傷和修復(fù)中發(fā)揮重要作用。

bFGF 也稱(chēng)為FGF-2，對(duì)成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等具有很強(qiáng)的促進(jìn)細(xì)胞分裂的增殖活性。其在促進(jìn)創(chuàng)傷愈合和組織修復(fù)、纖維化和瘢痕形成中發(fā)揮重要生物學(xué)作用[7]；此外，bFGF在促進(jìn)血管生成方面功能強(qiáng)大，通過(guò)與多種血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體相互作用，引起毛細(xì)血管基底膜降解，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖及膠原合成等，促進(jìn)血管生成的作用[8-9]。早期GRAZIANO[10]和SAADEH[11]等的研究表明，bFGF可以上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，VEGF的表達(dá)可隨bFGF的增加而升高。這些證據(jù)表明，bFGF 可能激活VEGF 系統(tǒng)，并與VEGF 發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)，在血管生成的過(guò)程中共同發(fā)揮作用。

PI3K/PKB通路在多種細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，如葡萄糖代謝、凋亡、細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞遷移[12]。PI3K 具有第2 信使作用，多種生長(zhǎng)因子和信號(hào)傳導(dǎo)復(fù)合物，包括bFGF、VEGF都能啟動(dòng)PI3K的激活過(guò)程，最終磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶蛋白的Ser308 導(dǎo)致PKB 活化[13-14]?；罨腜KB 可以通過(guò)激活核轉(zhuǎn)錄因子κB 等途徑，上調(diào)腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-1β及白細(xì)胞介素-6等炎癥因子的表達(dá)，參與輻射早期炎癥反應(yīng)，并可以通過(guò)胱天蛋白酶、內(nèi)皮型一氧化氮合酶等途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及血管生成等過(guò)程[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，放射性腸炎早期微血管損傷主要表現(xiàn)為通透性增加隨后破壞數(shù)量減少，以輻射后第7和14天病理改變最顯著。輻射后第1 ～7天小鼠小腸組織中VEGF、bFGF和PI3K/PKB通路mRNA相對(duì)表達(dá)量同步升高。此階段VEGF、bFGF 可能存在協(xié)同效應(yīng)，以增加微血管通透性和參與炎癥反應(yīng)作用為主，同時(shí)激活PI3K/PKB通路，通過(guò)上調(diào)炎癥因子表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等方式參與輻射后微血管破壞和組織損傷。輻射后第14天VEGF、bFGF mRNA相對(duì)表達(dá)量仍高于對(duì)照組，而PI3K/PKB通路mRNA相對(duì)表達(dá)量已經(jīng)降至對(duì)照組水平，且黏膜下急性炎癥反應(yīng)趨于消退。由于VEGF、bFGF 參與新生血管生長(zhǎng)及瘢痕生成過(guò)程，推測(cè)VEGF、bFGF 持續(xù)表達(dá)很可能與后期慢性放射性腸炎的新生血管生成、瘢痕形成等過(guò)程 有關(guān)。

氨磷汀為廣譜放療細(xì)胞保護(hù)劑，可通過(guò)清除自由基等機(jī)制對(duì)正常細(xì)胞起到保護(hù)作用。另有研究表明，氨磷汀通過(guò)不依賴于其自由基清除特性的機(jī)制保護(hù)血管免受放射線的影響[17-19]。其機(jī)制可能為促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)新生血管增殖，增加微血管數(shù)量 等[17-19]。干預(yù)組 mRNA在輻射后第1天表達(dá)低于輻射組，第7天時(shí)達(dá)到對(duì)照組水平，下降速度快于輻射組。第14天與對(duì)照組比較無(wú)差異，而輻射組VEGF、bFGF mRNA 第14天呈高表達(dá)。組織學(xué)觀察干預(yù)組微血管密度大于輻射組且結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。這表明氨磷汀可能通過(guò)下調(diào)輻射早期VEGF、bFGF mRNA 進(jìn)而下調(diào)PI3K/PKB通路的表達(dá)，從而減輕放射性腸炎的微血管損傷。

本實(shí)驗(yàn)觀察到，VEGF、bFGF和PI3K/PKB通路mRNA相對(duì)表達(dá)量高峰為輻射后第1天，組織學(xué)損傷的高峰為第7 ～14天，組織學(xué)損傷與mRNA在時(shí)間上存在滯后性，符合從分子學(xué)改變到組織學(xué)改變的規(guī)律。同時(shí)VEGF、bFGF在微血管消失和黏膜下層組織破壞嚴(yán)重的輻射組中持續(xù)表達(dá)，很可能在分子層面上啟動(dòng)促進(jìn)新生血管生成及瘢痕修復(fù)的機(jī)制，在后續(xù)異常新生血管形成、黏膜下纖維化、瘢痕形成中發(fā)揮作用，而損傷相對(duì)較輕的干預(yù)組并不存在VEGF、bFGF的持續(xù)表達(dá)。這一過(guò)程與肝硬化發(fā)生過(guò)程中肝竇破壞、纖維化、異常血管床和假小葉形成有一定相似之處，其中的VEGF、bFGF及TNF-α 等變化也非常相似。VEGF、bFGF 高表達(dá)者可能更容易出現(xiàn)白色瘢痕和異常增生的毛細(xì)血管簇相間現(xiàn)象。這與臨床嚴(yán)重的放射性腸炎內(nèi)鏡呈黏膜下血管網(wǎng)減少、白色瘢痕形成與周?chē)芗叵嚅g分布，而較輕者該表現(xiàn)不典型相符。

綜上所述，放射性腸炎的微血管損傷過(guò)程是早期破壞后數(shù)量減少，同時(shí)可能啟動(dòng)慢性放射性腸炎的病理機(jī)制，后期逐漸在周?chē)M織瘢痕形成的基礎(chǔ)上，新生血管代償性異常增殖，最終出現(xiàn)內(nèi)鏡下微血管分布失衡的表現(xiàn)。氨磷汀可能通過(guò)下調(diào)VEGF、bFGF和PI3K/PKB通路mRNA表達(dá)從而減輕急性放射性腸炎的微血管損傷，并可能在慢性放射性腸炎的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。