張躍偉，孫鎖柱，張丹，謝靜，張蓉，李長政

（1.錦州醫(yī)科大學火箭軍總醫(yī)院 研究生培養(yǎng)基地，遼寧 錦州121001；中國人民解放軍火箭軍特色醫(yī)學中心 2.病理科，3.消化科，4.中醫(yī)科，北京 100088）

近年來，隨著結直腸和婦科腫瘤放療患者的增多，放射性腸炎的發(fā)病率也呈逐年上升趨勢。放射性腸炎發(fā)病機制復雜，涉及細胞凋亡、微血管損傷、炎癥介質表達上調、免疫屏障破壞及腸道菌群失調等多個方面，其中微血管損傷是重要機制之一[1-2]。內鏡下放射性腸炎常呈黏膜下血管網減少與周圍血管集簇相間分布等特征性表現(xiàn)，可能與輻射后微血管損傷、數(shù)目減少、密度下降，黏膜下纖維化，殘留或新生血管異常生長等因素有關。但典型改變發(fā)生時間較晚，目前對急性期微血管損傷機制的研究相對較 少[3-4]。本實驗通過觀察輻射后第1、7及14天不同時間點輻射組和干預組小鼠小腸組織中血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）、堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）和磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B,PKB）通路mRNA表達變化，探討放射性腸炎早期微血管相關基因在微血管損傷發(fā)生、發(fā)展中的生物學意義及氨磷汀對微血管的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物及分組 清潔級健康C57BL/10J小鼠84只，3個月齡，雌雄各42只，雌鼠體重（20±2）g，雄鼠體重（28±2）g，由南京大學生物醫(yī)藥研究院培育[實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2018-0008]。將小鼠隨機分成對照組（12只）、輻射組（36只）、干預組（36只）。對照組未輻射，輻射組和干預組分別于輻射后第1、7和14天處死12只小鼠。

1.1.2 實驗試劑 固定組織RNA 提取試劑盒和UltraSYBR Mixture 試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司），RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒（美國賽默飛世爾公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 輻射60Co-γ 輻照裝置由北京師范大學化學學院提供，北京伽瑪高新有限公司生產（型號：GM-11-03-A），對輻射組小鼠進行一次性6 Gy 輻射，小鼠籠距輻射源≤30 cm，劑量率1.00 Gy/min，總時長6 min。干預組小鼠輻射前30 min 腹腔注射氨磷汀，按人體給藥劑量換算成小鼠給藥量為200 mg/kg。

1.2.2 標本制作分別于輻射后第1、7及14天采用頸椎脫臼法處死小鼠，取出小腸，用磷酸鹽緩沖液沖洗至無糞便殘留，剪切分段，分別置于10%甲醛中固定，-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 病理切片 常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、組織切片及HE 染色。

1.2.4 qRT-PCR 參照固定組織RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA。參照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒說明書進行逆轉錄。采用兩步法進行qRT-PCR，GAPDH 為內參，引物由北京天一輝遠科技有限公司提供。見表1。

1.3 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復測量設計的方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

表1 引物列表

2 結果

2.1 病理改變

光學顯微鏡下觀察，對照組小鼠小腸黏膜下微血管分布規(guī)律、結構完整（見圖1A）。輻射組與干預組第1天均可見微血管充血、擴張及紅細胞溢出等改變，且兩組無差異（見圖1B）；輻射組第7天黏膜下層微血管數(shù)量減少，血管壁變薄、破壞，干預組剩余血管數(shù)量多于輻射組，且結構相對完整（見圖1C、D）；輻射組第14天黏膜下層微血管進一步減少，階段性消失，結構完整的微血管罕見，黏膜、黏膜下結構紊亂及細胞數(shù)目減少，干預組無微血管階段性消失現(xiàn)象，仍可見結構完整的微血管（見圖1E、F）。

圖1 各組小鼠小腸黏膜病理切片（HE 染色×200）

2.2 qRT-PCR 擴增曲線和熔解曲線

各組VEGF、bFGF、PI3K及PKB基因不同CT值的擴增曲線平行性良好，其傾斜程度基本一致，說明目的基因與內參基因擴增效率一致。上述各目的基因和內參基因熔解曲線均在對應熔解溫度上形成單峰，說明產物特異性良好。在對照組和各不同時間點輻射組、干預組中分別選取一條代表性擴增曲線和熔解曲線（見圖2 ～9）。

2.3 對照組與輻射組VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對表達量比較

對照組與輻射組第1、7及14天小鼠小腸組織中VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對表達量比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組相比，輻射組第1和7天VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對表達量升高（P＜0.05），且輻射組 第14天VEGF、bFGF mRNA相對表達量仍升高（P＜0.05）。對照組與輻射組第14天PI3K、PKB mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2和圖10。

2.4 對照組與干預組VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對表達量比較

圖2 輻射組VEGF基因qRT-PCR 擴增曲線和熔解曲線

圖3 輻射組bFGF基因qRT-PCR 擴增曲線和熔解曲線

圖4 輻射組PI3K基因qRT-PCR 擴增曲線和熔解曲線

對照組和干預組第1、7及14天小鼠小腸組織中VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對表達量比較，經方差分析，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與對照組相比，干預組第1天VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對表達量均升高（P＜0.05）；對照組與干預組第7和14天VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對表達量比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3和圖11。

2.5 輻射組和干預組各時VEGF、bFGF、PI3K、PKB mRNA相對表達量比較

圖5 輻射組PKB基因qRT-PCR 擴增曲線和熔解曲線

圖6 干預組VEGF基因qRT-PCR 擴增曲線和熔解曲線

圖7 干預組bFGF基因qRT-PCR 擴增曲線和熔解曲線

輻射組與干預組第1、7及14天VEGF mRNA相對表達量比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的VEGF mRNA相對表達量有差別（F=75.66，P=0.000）；②兩組的VEGF mRNA相對表達量有差別（F=66.689，P=0.000），干預組較輻射組低；③兩組VEGF mRNA相對表達量變化趨勢有差別（F=16.975，P=0.000）。見表4。

輻射組與干預組第1、7及14天bFGF mRNA相對表達量比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的bFGF mRNA相對表達量有差別（F=75.289，P=0.000）；②兩組的bFGF mRNA相對表達量有差別（F=109.134，P=0.000），干預組較輻射組低；③兩組的bFGF mRNA相對表達量變化趨勢有差別（F=13.322，P=0.000）。見表5。

圖8 干預組PI3K基因qRT-PCR 擴增曲線和熔解曲線

圖9 干預組PKB基因qRT-PCR 擴增曲線和熔解曲線

表2 對照組與輻射組VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對表達量比較（n =12，±s）

表2 對照組與輻射組VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對表達量比較（n =12，±s）

注：?與對照組比較，P ＜0.05。

組別 VEGF mRNA bFGF mRNA PI3K mRNA PKB mRNA對照組 1.00±0.01 1.00±0.01 1.00±0.01 1.00±0.01輻射組第1天 13.07±1.09? 11.70±0.80? 13.02±0.93? 10.70±0.78?輻射組第7天 6.11±0.78? 6.45±0.95? 5.57±0.78? 5.96±0.43?輻射組第14天 2.39±0.30? 2.36±0.33? 1.22±0.14 1.37±0.22 F 值 35.358 27.311 55.597 60.286 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖10 對照組與輻射組VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對表達量比較（n =12，±s）

輻射組與干預組第1、7及14天的PI3K mRNA相對表達量比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的PI3K mRNA相對表達量有差別（F=79.914，P=0.000）；②兩組的PI3K mRNA相對表達量有差別（F=57.871，P=0.000），干預組較輻射組低；③兩組的PI3K mRNA相對表達量變化趨勢有差別（F=9.597，P=0.001）。見表6。

輻射組與干預組第1、7及14天的PKB mRNA相對表達量比較，采用重復測量設計的方差分析，結果：①不同時間點的PKB mRNA相對表達量有差別（F=84.241，P=0.000）；②輻射組與干預組的PKB mRNA相對表達量有差別（F=103.748，P=0.000），干預組較輻射組低；③兩組的PKB mRNA相對表達量變化趨勢有差別（F=33.951，P=0.001）。見表7。

表3 對照組與干預組VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對表達量比較（n =12，±s）

表3 對照組與干預組VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對表達量比較（n =12，±s）

注：?與對照組比較，P ＜0.05。

組別 VEGF mRNA bFGF mRNA PI3K mRNA PKB mRNA對照組 1.00±0.01 1.00±0.01 1.00±0.01 1.00±0.01干預組第1天 5.16±0.58? 4.92±0.43? 6.80±0.85? 3.43±0.39? 干預組第7天 1.18±0.11 1.37±0.18 1.16±0.13 1.70±0.24干預組第14天 1.14±0.15 1.13±0.17 1.32±0.19 1.16±0.16 F 值 25.257 37.629 28.630 12.172 P 值 0.000 0.000 0.000 0.000

圖11 對照組與干預組VEGF、bFGF、PI3K及PKB mRNA相對表達量比較（n =12，±s）

表4 輻射組和干預組各時間點VEGF mRNA相對表達量 比較（n =12，±s）

表4 輻射組和干預組各時間點VEGF mRNA相對表達量 比較（n =12，±s）

組別 第1天 第7天 第14天輻射組 13.07±1.09 6.11±0.78 2.39±0.30干預組 5.16±0.58 1.18±0.11 1.14±0.15

表5 輻射組和干預組各時間點bFGF mRNA相對表達量 比較（n =12，±s）

表5 輻射組和干預組各時間點bFGF mRNA相對表達量 比較（n =12，±s）

組別 第1天 第7天 第14天輻射組 11.70±0.80 6.45±0.95 2.36±0.33干預組 4.92±0.43 1.37±0.18 1.13±0.17

表6 輻射組和干預組各時間點PI3K mRNA相對表達量 比較（n =12，±s）

表6 輻射組和干預組各時間點PI3K mRNA相對表達量 比較（n =12，±s）

組別 第1天 第7天 第14天輻射組 13.02±0.93 5.57±0.78 1.22±0.14干預組 6.80±0.85 1.16±0.13 1.32±0.19

表7 輻射組和干預組各時間點PKB mRNA相對表達量 比較（n =12，±s）

表7 輻射組和干預組各時間點PKB mRNA相對表達量 比較（n =12，±s）

組別 第1天 第7天 第14天輻射組 10.70±0.78 5.96±0.43 1.37±0.22干預組 3.43±0.39 1.70±0.24 1.16±0.16

3 討論

VEGF是最有效的血管生成生長因子之一，具有增加血管通透性，促進細胞外基質變性、血管內皮細胞遷移、增殖及血管形成等作用[5]。有研究表明，血管在發(fā)育過程中，尖端細胞可感知VEGF的梯度，導致絲狀偽足形成，并向VEGF 梯度遷移[6]。血管生成對于傷口愈合、組織再生及炎癥性疾病至關重要，也在輻射損傷和修復中發(fā)揮重要作用。

bFGF 也稱為FGF-2，對成纖維細胞、血管內皮細胞等具有很強的促進細胞分裂的增殖活性。其在促進創(chuàng)傷愈合和組織修復、纖維化和瘢痕形成中發(fā)揮重要生物學作用[7]；此外，bFGF在促進血管生成方面功能強大，通過與多種血管內皮細胞表面的受體相互作用，引起毛細血管基底膜降解，毛細血管內皮細胞遷移、增殖及膠原合成等，促進血管生成的作用[8-9]。早期GRAZIANO[10]和SAADEH[11]等的研究表明，bFGF可以上調內皮細胞中VEGF的表達，VEGF的表達可隨bFGF的增加而升高。這些證據(jù)表明，bFGF 可能激活VEGF 系統(tǒng)，并與VEGF 發(fā)揮協(xié)同效應，在血管生成的過程中共同發(fā)揮作用。

PI3K/PKB通路在多種細胞生長過程中發(fā)揮關鍵作用，如葡萄糖代謝、凋亡、細胞增殖、轉錄及細胞遷移[12]。PI3K 具有第2 信使作用，多種生長因子和信號傳導復合物，包括bFGF、VEGF都能啟動PI3K的激活過程，最終磷酸化絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶蛋白的Ser308 導致PKB 活化[13-14]。活化的PKB 可以通過激活核轉錄因子κB 等途徑，上調腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-1β及白細胞介素-6等炎癥因子的表達，參與輻射早期炎癥反應，并可以通過胱天蛋白酶、內皮型一氧化氮合酶等途徑調節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡及血管生成等過程[15-16]。

本實驗結果表明，放射性腸炎早期微血管損傷主要表現(xiàn)為通透性增加隨后破壞數(shù)量減少，以輻射后第7和14天病理改變最顯著。輻射后第1 ～7天小鼠小腸組織中VEGF、bFGF和PI3K/PKB通路mRNA相對表達量同步升高。此階段VEGF、bFGF 可能存在協(xié)同效應，以增加微血管通透性和參與炎癥反應作用為主，同時激活PI3K/PKB通路，通過上調炎癥因子表達、誘導細胞凋亡等方式參與輻射后微血管破壞和組織損傷。輻射后第14天VEGF、bFGF mRNA相對表達量仍高于對照組，而PI3K/PKB通路mRNA相對表達量已經降至對照組水平，且黏膜下急性炎癥反應趨于消退。由于VEGF、bFGF 參與新生血管生長及瘢痕生成過程，推測VEGF、bFGF 持續(xù)表達很可能與后期慢性放射性腸炎的新生血管生成、瘢痕形成等過程 有關。

氨磷汀為廣譜放療細胞保護劑，可通過清除自由基等機制對正常細胞起到保護作用。另有研究表明，氨磷汀通過不依賴于其自由基清除特性的機制保護血管免受放射線的影響[17-19]。其機制可能為促進內皮細胞生長，促進新生血管增殖，增加微血管數(shù)量 等[17-19]。干預組 mRNA在輻射后第1天表達低于輻射組，第7天時達到對照組水平，下降速度快于輻射組。第14天與對照組比較無差異，而輻射組VEGF、bFGF mRNA 第14天呈高表達。組織學觀察干預組微血管密度大于輻射組且結構相對完整。這表明氨磷汀可能通過下調輻射早期VEGF、bFGF mRNA 進而下調PI3K/PKB通路的表達，從而減輕放射性腸炎的微血管損傷。

本實驗觀察到，VEGF、bFGF和PI3K/PKB通路mRNA相對表達量高峰為輻射后第1天，組織學損傷的高峰為第7 ～14天，組織學損傷與mRNA在時間上存在滯后性，符合從分子學改變到組織學改變的規(guī)律。同時VEGF、bFGF在微血管消失和黏膜下層組織破壞嚴重的輻射組中持續(xù)表達，很可能在分子層面上啟動促進新生血管生成及瘢痕修復的機制，在后續(xù)異常新生血管形成、黏膜下纖維化、瘢痕形成中發(fā)揮作用，而損傷相對較輕的干預組并不存在VEGF、bFGF的持續(xù)表達。這一過程與肝硬化發(fā)生過程中肝竇破壞、纖維化、異常血管床和假小葉形成有一定相似之處，其中的VEGF、bFGF及TNF-α 等變化也非常相似。VEGF、bFGF 高表達者可能更容易出現(xiàn)白色瘢痕和異常增生的毛細血管簇相間現(xiàn)象。這與臨床嚴重的放射性腸炎內鏡呈黏膜下血管網減少、白色瘢痕形成與周圍血管集簇相間分布，而較輕者該表現(xiàn)不典型相符。

綜上所述，放射性腸炎的微血管損傷過程是早期破壞后數(shù)量減少，同時可能啟動慢性放射性腸炎的病理機制，后期逐漸在周圍組織瘢痕形成的基礎上，新生血管代償性異常增殖，最終出現(xiàn)內鏡下微血管分布失衡的表現(xiàn)。氨磷汀可能通過下調VEGF、bFGF和PI3K/PKB通路mRNA表達從而減輕急性放射性腸炎的微血管損傷，并可能在慢性放射性腸炎的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮作用。