[山東第一醫(yī)科大學(xué)（山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院），山東 泰安 271016]

先天性心臟病（congenital heart disease,CHD）作為病因未明的多基因遺傳病，發(fā)病率逐年上升，給家庭與社會(huì)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1-4]。TBX5屬于T-box基因家族一員[5-7]，與心臟正常發(fā)育有關(guān)[8-9]。研究表明，基因3'非翻譯區(qū)受microRNA（miRNA）靶向調(diào)控，miRNAs 靶序列單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）可通過影響靶基因表達(dá)水平進(jìn)而影響個(gè)體對(duì)疾病的易感性。但關(guān)于TBX53'非翻譯區(qū)SNP與CHD的相關(guān)性研究尚不多見。本研究對(duì)TBX53'非翻譯區(qū)SNP與CHD 易感性的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年12月—2015年5月在山東大學(xué)齊魯兒童醫(yī)院就診的186例部分單純CHD患兒（病例組）。所有病例經(jīng)臨床診斷、心臟彩超診斷、X 射線或CT 影像檢查（優(yōu)先考慮前兩個(gè)診斷），且排除心血管之外的畸形和無家族遺傳史的非綜合征CHD患兒。所有對(duì)照為本院同期兒童保健科就診的200例健康體檢兒童（對(duì)照組），均排除遺傳性疾病。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)簽SNP的選取 ①獲取TBX5基因及區(qū)域內(nèi)的SNP 信息：首先從GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）獲取人類TBX5基因的染色體位置及序列信息，之后從HapMap 數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/）選 擇Project Data HapMap Genome Browser release #28（phases 1,2 & 3-merged genotypes & frequencies）獲得中國(guó)北京漢族人中TBX5基因SNP位點(diǎn)的基因型數(shù)據(jù)；②將獲得的中國(guó)北京漢族人群中TBX5基因所有SNP位點(diǎn)基因型數(shù)據(jù)分別導(dǎo)入Haploview 4.2，找出最小等位基因頻率（minor allele frequency,MAF）≥5%的常見SNP，計(jì)算各個(gè)基因內(nèi)SNP位點(diǎn)間的連鎖不平衡（linkage disequilibrium,LD）程度數(shù)據(jù)（r2值），根據(jù)r2值大小構(gòu)建Block 圖譜并篩選具有代表性的標(biāo)簽SNP位點(diǎn)；③標(biāo)簽SNP 選擇：根據(jù)列出每個(gè)單倍域內(nèi)r2≥0.8的SNP，然后選出與Block 內(nèi)其余SNP 之間r2≥0.8個(gè)數(shù)最多，且r2平均值最大一個(gè)位于3'非翻譯區(qū)的SNP作為標(biāo)簽SNP，如若同時(shí)有多個(gè)SNP 符合條件，則結(jié)合本次研究目的優(yōu)先考慮3'非翻譯區(qū)的標(biāo)簽SNP。

1.2.2TBX5基因3'UTR qPCR-HRM 擴(kuò)增 提取研究對(duì)象外周靜脈血基因組DNA，通過查詢NCBI GenBank 獲得TBX5基因3'非翻譯區(qū)原始序列，并以此為基礎(chǔ)，利用在線Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)高分辨率熔解曲線所需引物，在LightCycler? 96 熒光定量PCR儀（瑞士羅氏公司）上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系總體積10μl：基因組DNA 1μl，Mg2+1.6μl，高分辨率熔解曲 線（high resolution melting analysis,HRM）Master Mix 10μl，正、反向引物各1μl，雙蒸水5.4μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，95℃變性10 s，65℃退火15 s，60℃延伸15 s，45個(gè)循環(huán)。HRM分析：95℃預(yù)變性1 min，40℃變性1 min，65℃退火1 s，65℃～97℃（0.07℃/s），37℃冷卻30 s。反應(yīng)結(jié)束后，通過LightCycler? 96軟件中的High Resolution Melting模塊對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，基因分型。

1.2.3 PCR 產(chǎn)物測(cè)序 隨機(jī)選取利用HRM 成功分型的TBX5基因rs883079位點(diǎn)3個(gè)基因型G/G、G/A及A/A 各10個(gè)樣本，應(yīng)用Sanger雙脫氧鏈終止法進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與HRM分型結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗(yàn)，計(jì)算基因各個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)的基因型頻率和等位基因頻率；運(yùn)用Hardy-Weinberg平衡在線檢測(cè)程序檢驗(yàn)研究樣本是否具有群體代表性；比值比（odds ratio,OR）及其95% CI 以非條件Logistic 回歸分析計(jì)算，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組性別、年齡比較

兩組性別、年齡比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 標(biāo)簽SNP 篩選

根據(jù)基因內(nèi)SNP 之間連鎖不平衡程度，采用HaploView軟件構(gòu)建TBX5基因SNP間的Block圖。HaploView軟件運(yùn)行結(jié)果顯示，TBX5基因內(nèi)共構(gòu)成 5個(gè)Block，且結(jié)果只有SNP rs883079 符合預(yù)設(shè)篩選3'非翻譯區(qū)標(biāo)簽SNP 條件。見圖1。

2.3 TBX5 等位基因分型結(jié)果

以經(jīng)過測(cè)序的野生型DNA 樣品作為標(biāo)準(zhǔn)品，HRM分析檢測(cè)TBX5基因目的片段。選取HRM 3種分型樣品進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序峰圖證實(shí)TBX5基因3'非翻譯區(qū)rs883079位點(diǎn)存在3種基因型，且與HRM結(jié)果一致。見圖2、3。

圖1 TBX5基因構(gòu)建Block

2.4 TBX5基因多態(tài)位點(diǎn)各基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)比較

圖2 qPCR-HRM 基因分型

TBX5基因多態(tài)位點(diǎn)各基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.378，P=0.539）。TBX5基因rs883079（G＞A）基因型在對(duì)照組中分布符合Hardy-Weinberg平衡，可認(rèn)為對(duì)照組人群來自總體人群，不存在選擇性偏倚，具有群體代表性。見表1。

2.5 兩組TBX5 等位基因頻率分布比較

兩組TBX5等位基因頻率分布比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。突變等位基因A 為CHD的危險(xiǎn)性基因（P＜0.05）；攜帶A/A 基因型的個(gè)體相對(duì)于攜帶G/G 基因型者患CHD的危險(xiǎn)性增加，提示A/A 可能為CHDs的危險(xiǎn)基因型。見表2。

2.6 TBX5基因多態(tài)性與不同類型CHD的關(guān)系

圖3 TBX5基因rs883079位點(diǎn)3種基因型測(cè)序圖

表1 TBX5基因多態(tài)位點(diǎn)各基因型分布Hardy-Weinberg平衡檢測(cè)比較 %

按照CHD 具體表型分層，對(duì)TBX5基因標(biāo)簽SNP rs883079 進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，盡管rs883079 突變純合子A/A 基因型與CHD 易感性相關(guān)，但其風(fēng)險(xiǎn)程度在不同類型的CHD 中仍有差異。TBX5基因rs883079（G＞A）位點(diǎn)中，以攜帶G/G 野生純合子基因型者為對(duì)照，攜帶突變純合子基因型A/A的個(gè)體患間隔缺損的危險(xiǎn)性升高。對(duì)于室間隔缺損患兒，以攜帶G/G 野生純合子基因型者為對(duì)照，TBX5基因rs883079 多態(tài)，G/A 基因型、A/A 基因型或是G/A+A/A 基因型均未見該位點(diǎn)與室間隔缺損有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。對(duì)于房間隔缺損患兒，以攜帶G/G 野生純合子基因型者為對(duì)照，TBX5基因rs883079 多態(tài)無論是A/A 基因型或是G/A+A/A 基因型都與CHD 風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)（P＜0.05）。提示TBX5的該非編碼區(qū)多態(tài)主要與CHD 房間隔缺損相關(guān)，或是其危險(xiǎn)因素。見表3。

表2 SNP位點(diǎn)等位基因和基因型在病例組和對(duì)照組中的分布

表3 TBX5基因多態(tài)性與不同類型CHD的關(guān)系

3 討論

隨著分子遺傳學(xué)的發(fā)展，CHD 遺傳因素的作用受到了越來越多的重視。心臟發(fā)育相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子在CHD 發(fā)病機(jī)制中的重要作用已在一些生物模式中得到證實(shí)。與心臟發(fā)育密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子異?？蓪?dǎo)致嚴(yán)重的CHD。TBX5是心臟早期發(fā)育過程中極為重要的轉(zhuǎn)錄因子之一，能通過與另外2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子GATA4、NKX2-5在基因和蛋白水平上相互作用，調(diào)節(jié)心室特化、房室分隔等一系列心臟發(fā)育過程[10]。

SNP與疾病易感性的研究已廣泛報(bào)道[11]。CHD與SNP 遺傳多態(tài)性的研究是近年來CHD 病因研究的熱點(diǎn)與重點(diǎn)之一。已有研究發(fā)現(xiàn)，一些位于TBX5基因SNP 同心臟相關(guān)疾病有關(guān)。LIU 等[12]對(duì)192例中國(guó)漢族室間隔缺損患兒研究結(jié)果顯示，在TBX5基因找到與室間隔缺損易感SNP（rs11067075）。SINNER 等[13]對(duì)心房顫動(dòng)患者研究發(fā)現(xiàn)，TBX5基因rs10507248 多態(tài)與心房顫動(dòng)有關(guān)。王鳳等[14-15]對(duì)室間隔缺損患兒和健康對(duì)照的TBX5基因3'非翻譯區(qū)相關(guān)SNP 進(jìn)行基因分型和關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果顯示TBX5基因3'非翻譯區(qū)rs6489956（C＞T）多態(tài)位點(diǎn)可增加室間隔缺損的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，功能研究發(fā)現(xiàn)T 等位基因能增強(qiáng)miR-9和miR-30a的負(fù)向調(diào)控，導(dǎo)致TBX5基因的表達(dá)差異。

本研究測(cè)序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，與HRM 結(jié)果一致。筆者基于病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)，依據(jù)基因分型結(jié)果探討rs6489956（C＞T）位點(diǎn)SNP與CHD的關(guān)聯(lián)，該位點(diǎn)基因型在兩組分布比較有差異。筆者依據(jù)CHD的具體表型進(jìn)行分層分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)于房間隔缺損患兒，TBX5基因rs883079 多態(tài)性A/A 基因型或是G/A+A/A基因型相對(duì)于G/G 野生純合子基因型者有增加CHD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)，未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)多態(tài)性與室間隔缺損之間的關(guān)聯(lián)，猜測(cè)TBX5rs883079位點(diǎn)SNP 可能是CHD房間隔缺損的危險(xiǎn)因素。

有證據(jù)顯示，TBX5基因rs883079位點(diǎn)與心臟生理活動(dòng)有關(guān)。一項(xiàng)GWAS 研究發(fā)現(xiàn)，該位點(diǎn)與QRS時(shí)限和心室傳導(dǎo)有關(guān)[16]。PAZOKI 等[17]在心室顫動(dòng)的一項(xiàng)研究中也表明該位點(diǎn)與心電圖QRS 時(shí)限相關(guān)。POLYMIRTS 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)當(dāng)多態(tài)性位點(diǎn)rs883079 等位基因?yàn)镚 時(shí)，只有hsa-miR-132-5p 可能靶向結(jié)合該區(qū)域，當(dāng)?shù)任换驗(yàn)锳 時(shí)，包括hsa-miR-1231在內(nèi)的11個(gè)miRNA 可能靶向結(jié)合[18-19]。因此，當(dāng)rs883079位點(diǎn)等位基因發(fā)生改變時(shí)，可能會(huì)影響這些miRNA的靶向調(diào)控，引起TBX5基因在翻譯水平的改變，從而影響心臟發(fā)育，導(dǎo)致CHD的發(fā)生。有關(guān)TBX5基因rs883079位點(diǎn)SNP與CHD，特別是室間隔缺損關(guān)系的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步行分子實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。