多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）為骨髓漿細(xì)胞惡性疾病，約占整個(gè)血液系統(tǒng)惡性腫瘤的10%以上，多見(jiàn)于老年人，現(xiàn)階段隨著人口老齡化進(jìn)程的加快，我國(guó)MM的發(fā)病率逐年升高[1]。目前MM的治療主要通過(guò)聯(lián)合化療及自體干細(xì)胞移植，然而治療過(guò)程中僅有一小部分患者受益，絕大多數(shù)患者的生存和預(yù)后并未得到改善，因此尋找更有效的治療方案與手段對(duì)改善MM患者的預(yù)后具有重要意義[2，3]。磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）由蛋白質(zhì)合成，在轉(zhuǎn)錄與翻譯過(guò)程中調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，與腫瘤的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，參與細(xì)胞周期調(diào)節(jié)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[4，5]。本研究通過(guò)檢測(cè)MM患者骨髓血漿PI3K水平，判斷其在不同分期患者中的差異，闡述其與患者預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月～2015年5月我院住院MM患者40例，其中男19例，女21例；年齡40～75歲，平均（56.33±3.59）歲；依照DS分期標(biāo)準(zhǔn)包括Ⅰ期10例，Ⅱ期12例，Ⅲ期18例。另選取同期于我院門(mén)診就診者，通過(guò)臨床和骨髓穿刺排除血液疾病，其中男20例，女20例；年齡41～77歲，平均（56.18±3.66）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均簽訂骨髓穿刺同意書(shū)，通過(guò)臨床和骨髓穿刺、免疫固定電泳等檢查確診；②經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及家屬知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①肝實(shí)質(zhì)病變或有機(jī)磷中毒者；②原發(fā)性漿細(xì)胞白血病或反應(yīng)性漿細(xì)胞增多癥者；③合并慢性呼吸道疾??；④合并其他惡性腫瘤、創(chuàng)傷或感染者；⑤合并其他全身性疾病者。

1.2 免疫組織化學(xué)法 所有非腫瘤骨髓組織標(biāo)本通過(guò)10%的中性福爾馬林進(jìn)行固定，通過(guò)石蠟包埋后制片，通過(guò)免疫組織化學(xué)SP三步法進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，修復(fù)抗原，在室溫條件下以3%的H2O2孵育20min，滅活過(guò)氧化物酶活性，PBS液沖洗，滴加正常山羊血清工作液，于室溫條件下孵育20min，加入一抗，4℃條件下放置12h，再次以PBS液沖洗，滴加二抗，孵育25min，再以PBS液沖洗，加入辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液，孵育25min，PBS液沖洗，以DAB顯色液顯色，最后采用蒸餾水沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片。

1.3 染色結(jié)果判斷 由2名病理科醫(yī)師采用雙盲法評(píng)估。在高倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)以上的不同高倍鏡視野，同時(shí)需保證每一個(gè)視野能夠觀(guān)察到的細(xì)胞數(shù)在200個(gè)以上，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)淡黃色或棕黃色，依照陽(yáng)性細(xì)胞所占的百分比進(jìn)行評(píng)分[6]：陽(yáng)性細(xì)胞≤5%計(jì)0分，陽(yáng)性細(xì)胞為5%～10%計(jì)1分，11%～50%計(jì)2分，51%～75%計(jì)3分，＞75%計(jì)4分，0分為無(wú)表達(dá)（-），1分為低表達(dá)（+），2分為中度表達(dá)（++），3分為高表達(dá)（+++），4分為極高表達(dá)（++++）。

1.4 化療方案 采用VAD+MelP（VCR 0.5mg d1～d4，THP 10mg d1～d4，DEX 20mg d1～d4，MelP 6mg Bid d1～d4），合并腎功能不全者，可依據(jù)肌酐清除率水平調(diào)整MelP用量；合并尿毒癥患者，不使用MelP；合并骨骼病變患者，化療前使用兩次2、3代骨磷酸鹽，骨骼癥狀明顯或孤立病灶加用局部治療。

1.5 臨床病理特征

1.5.1 DS臨床分期標(biāo)準(zhǔn) Ⅰ期：血鈣正常，血紅蛋白≥100g/L，X線(xiàn)顯示骨髓表現(xiàn)正常或僅存在少量孤立性漿細(xì)胞，IgA＜30g/L，IgG＜50g/L，尿本周蛋白＜4g/24h；Ⅱ期：介于Ⅰ期和Ⅲ期之間；Ⅲ期：符合以下一項(xiàng)或多項(xiàng)：血紅蛋白＜85g/L，血鈣水平＞2.98mmol/L，多處發(fā)生溶骨性病變，IgA＞50g/L，IgG＞70g/L，尿本周蛋白＞12g/24h[7]。

1.5.2 ISS分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 1級(jí)：血清β2微球蛋白含量＜3.5mg/L，血清白蛋白含量＞35g/L；2級(jí)：介于1級(jí)和3級(jí)之間；3級(jí)：血清β2微球蛋白含量＞5.5mg/L[8]。

1.5.3 骨病分級(jí) 0級(jí)：未出現(xiàn)骨質(zhì)破壞；1級(jí)：普通骨質(zhì)疏松或有1處出現(xiàn)骨質(zhì)溶骨性破壞；2級(jí)：超過(guò)1處少于3處出現(xiàn)骨質(zhì)破壞癥狀；3級(jí)：超過(guò)3處出現(xiàn)骨質(zhì)破壞，或出現(xiàn)病理或壓縮性骨折[9]。

1.5.4 生活自理狀況 1級(jí)：患者存在臨床癥狀，但不影響日常生活；2級(jí)：患者日常生活可自理，且每日需臥床休息半天以下；3級(jí)：患者日常生活可自理，且每日需臥床休息半天以上；4級(jí)：患者臥床不起，生活不能自理[10]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，率之間的比較采用卡方檢驗(yàn)，生存率分析通過(guò)Kaplan-Meier模型，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PI3K在正常及MM骨髓組織中的表達(dá) MM患者骨髓組織中PI3K陽(yáng)性表達(dá)率高于正常骨髓組織，見(jiàn)表1。

表1 PI3K在正常與MM骨髓組織中的表達(dá)情況比較

2.2 PI3K表達(dá)和臨床病理特征之間的關(guān)系 骨質(zhì)破壞≥3分、日常生活自理能力較差患者PI3K陽(yáng)性率高于其他患者，DS分期Ⅲ期患者PI3K陽(yáng)性率高于Ⅰ～Ⅱ期患者，ISS分級(jí)3級(jí)患者PI3K陽(yáng)性率高于1～2級(jí)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表2。

表2 MM骨髓組織中PI3K表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]

2.3 PI3K陽(yáng)性與陰性表達(dá)MM患者化療后生存時(shí)間 PI3K陰性患者3年無(wú)進(jìn)展生存率為72.73%，高于PI3K陽(yáng)性組48.28%（P<0.05）；PI3K陰性患者3年總生存率為81.82%，高于PI3K陽(yáng)性患者62.07%，（P<0.05）。見(jiàn)圖1、2。

圖1 3年無(wú)進(jìn)展生存率

圖2 3年總生存率

3 討論

MM腫瘤細(xì)胞起源于漿細(xì)胞，其發(fā)病和癌基因的激活與抑癌基因的失活及骨髓微環(huán)境的改變、多種細(xì)胞因子相互作用等因素有密切關(guān)系，患者常伴有多發(fā)性溶骨性損害、貧血、高鈣血癥、腎臟損害，患者由于正常的免疫球蛋白的生成受到抑制，易導(dǎo)致各種細(xì)菌性感染的發(fā)生[11]。

PI3K由一個(gè)催化亞基和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基構(gòu)成，細(xì)胞受到生長(zhǎng)因子刺激后，PI3K活化[12]。PI3K下游的Akt可與PIP3結(jié)合，并經(jīng)磷脂酰肌醇依賴(lài)性激酶1，2使第308位上的蘇氨酸及473位上的絲氨酸被激活?；罨蟮腜I3K/Akt通路激活哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白，磷酸化后進(jìn)一步激活P70S6激酶，使下游核糖體S6激酶活化，促進(jìn)核糖體蛋白的翻譯過(guò)程，與此同時(shí)哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白還可將4EBP1磷酸化，使其從elF4E中解離，促進(jìn)后者對(duì)于cyclinD1等周期調(diào)節(jié)蛋白的翻譯過(guò)程。PI3K信號(hào)通路可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，具有抗凋亡和調(diào)節(jié)瘤細(xì)胞生存的作用，還有利于血管的形成，增強(qiáng)腫瘤的侵襲性，促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[13]。

本研究中MM患者骨髓組織PI3K陽(yáng)性率明顯高于正常組織，MM組織中PI3K信號(hào)活化，促進(jìn)瘤細(xì)胞增殖與分化過(guò)程，反過(guò)來(lái)又進(jìn)一步活化更多PI3K信號(hào)，使得PI3K濃度進(jìn)一步升高。本研究對(duì)比各種免疫類(lèi)型骨髓血漿PI3K陽(yáng)性率差異，其中IgE和IgD類(lèi)型本研究未納入有效病例，對(duì)比其他幾種免疫類(lèi)型和PI3K陽(yáng)性率的關(guān)系，IgG型、IgA型、輕鏈型PI3K陽(yáng)性率均未有明顯差異，提示PI3K表達(dá)增高可能是各種類(lèi)型MM患者表現(xiàn)出的一種共同信號(hào)，也有可能與本研究所納入的樣本數(shù)量過(guò)少有關(guān)。DS臨床分期側(cè)重評(píng)估患者總體瘤負(fù)荷，涉及多種參數(shù)[14]。本研究中Ⅲ期患者PI3K陽(yáng)性率高于Ⅰ、Ⅱ期患者，表明患者體內(nèi)PI3K水平和瘤負(fù)荷相關(guān)。ISS臨床分期是近年來(lái)提出的MM臨床分期指標(biāo)，雖只涉及血清β2微球蛋白和血清白蛋白含量，但血清β2微球蛋白和體內(nèi)骨髓瘤細(xì)胞總數(shù)密切相關(guān)，血清白蛋白是負(fù)性急性期蛋白，與瘤細(xì)胞的生活與增殖具有密切關(guān)系，因此ISS臨床分期在預(yù)測(cè)MM患者化療治療后的生存情況方面具有重要價(jià)值，本研究中ISS臨床分期和MM患者PI3K陽(yáng)性率相關(guān)，提示瘤負(fù)荷狀態(tài)，對(duì)于負(fù)荷越高者，其包括自分泌或旁分泌在內(nèi)激活的PI3K信號(hào)的途徑則越強(qiáng)，上述研究顯示，PI3K陽(yáng)性表達(dá)率越高者，疾病分期更接近于晚期。

林琳等[15]研究表明骨骼破壞為MM患者最常見(jiàn)的臨床癥狀之一，瘤細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞相互黏附后激活大量破骨細(xì)胞激活因子等，導(dǎo)致破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞動(dòng)態(tài)平衡遭到破壞，造成溶骨性破壞。MM患者瘤負(fù)荷越高，骨質(zhì)破壞越嚴(yán)重。本研究中PI3K水平與骨髓瘤的分級(jí)有關(guān)，PI3K的陽(yáng)性表達(dá)率隨骨質(zhì)破壞嚴(yán)重程度增高。同時(shí)本研究中患者日常生活自理能力與PI3K陽(yáng)性表達(dá)率存在一定的關(guān)系，這也從側(cè)面說(shuō)明了PI3K的陽(yáng)性表達(dá)和骨髓病變的嚴(yán)重程度相關(guān)，Piddock 等[16]研究結(jié)果支持本結(jié)論。對(duì)兩組患者隨訪(fǎng)至化療治療后3年，PI3K陽(yáng)性表達(dá)患者3年無(wú)進(jìn)展生存率與總生存率均低于PI3K陰性表達(dá)患者，闡明了PI3K在預(yù)測(cè)MM患者預(yù)后方面的價(jià)值。

綜上所述，PI3K在MM骨髓組織中高表達(dá)，與患者臨床病理特征具有密切關(guān)系，可作為判斷MM患者預(yù)后的標(biāo)志物之一。