我國已進(jìn)入老齡化社會，腦卒中已成為死亡的重要原因之一。其包括缺血性腦卒中及出血性腦卒中，在腦血管疾病中缺血性腦卒中的發(fā)病率一直居高不下。迄今為止，腦卒中尚缺乏有效的臨床治療手段。曾患腦卒中的患者，再次發(fā)生心腦血管疾病的可能性相比較正常人也普遍偏高，因此治療腦卒中是一個漫長的過程，患者需要忍受巨大痛苦，同時給社會和家庭帶來沉重負(fù)擔(dān)[1，2]。

近年來，關(guān)于腦卒中的免疫理論普遍認(rèn)為腦卒中后T淋巴細(xì)胞被過多激活，可以分泌產(chǎn)生大量促炎性細(xì)胞因子。炎癥因子不僅在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而且對于內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持也至關(guān)重要。并且進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中患者發(fā)病時病情越嚴(yán)重，患者體內(nèi)微環(huán)境的動態(tài)平衡越易被打破，免疫調(diào)節(jié)功能同時被激活，隨之引發(fā)一系列的連鎖反應(yīng)，最重要的是，炎性相關(guān)介質(zhì)的分泌增多對腦卒中的進(jìn)展起到重要作用。

對microRNAs（miRNA）的研究非常廣泛，在實體腫瘤、血液系統(tǒng)疾病，以及神經(jīng)損傷修復(fù)方面都有著深入的研究，作為一類長度為22nt左右的非編碼小RNA，分子量雖然小，結(jié)構(gòu)相對簡單，但能夠發(fā)揮巨大的生物學(xué)作用。普遍認(rèn)為miRNA通過抑制或者激活信號通路中特定的靶基因發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，腦卒中患者血清miR-21的表達(dá)明顯上調(diào)，但miR-21參與腦卒中的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。miR-21可通過下調(diào)PDCD4的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞增殖[2]。另外，miR-21的過表達(dá)可以抑制正常細(xì)胞凋亡的信號傳導(dǎo)，因此，抑制miR-21可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

腦卒中發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，病情變化多樣，復(fù)發(fā)風(fēng)險較高。血清中的細(xì)胞因子和miRNA與腦卒中的發(fā)病有著密切聯(lián)系[3]，可能為判斷預(yù)后和預(yù)測復(fù)發(fā)提供一定的方向。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取山東省安丘市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科2013年1月1日～2014年12月31日的急性腦梗死患者，年齡30～80歲，符合急性腦梗死的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，首次發(fā)病至入院時間在 12h之內(nèi)，所有患者經(jīng)過頭顱CT或MRI檢查證實，此作為腦梗死組（ACI組）。對照組為同時期的正常健康體檢者。本研究中采用的所有標(biāo)本均為臨床檢查后廢棄樣本。所有樣本以及患者病歷經(jīng)過我院倫理中心審查，符合倫理規(guī)范。

1.2 臨床神經(jīng)功能缺損程度評分 依據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院腦卒中量表（NIH Stroke Scale，NIHSS）對腦梗死組發(fā)病后12h、1d、3d、5d、7d、14d進(jìn)行評分。為提高評分準(zhǔn)確性，操作前進(jìn)行人員培訓(xùn)，對每位患者進(jìn)行評分時，均由同一名神經(jīng)科醫(yī)師進(jìn)行，以提高評分準(zhǔn)確性。

1.3 ELISA檢測血清中IL-6和STAT3的含量 血清IL-6和STAT3的檢測采用雙抗體夾心抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）法（美國Abcam，ab46042）。ACI組：收集患者發(fā)病后12h、1d、3d、5d、7d、14d的靜脈血3～5ml，放置于真空促凝管中，在4℃冰箱里靜置60min，2 500r/min，離心10min，收集血清，分裝2～4管，每管400～500μl，進(jìn)行標(biāo)記，放置于-20℃的冰箱中保存。對照組抽取靜脈血1次3～5ml，血清收集同ACI組。在酶標(biāo)儀上450nm處測光密度（OD值），IL-6和STAT3濃度與OD值成正比，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求得IL-6和STAT3的濃度。

1.4 實時定量PCR檢測血清中miR-21的含量提取血清miRNA后，采用試劑盒進(jìn)行miRNA逆轉(zhuǎn)錄。miRNA逆轉(zhuǎn)錄：實時定量PCR，引物：U6引物，miR-21引物（美國Genecopoeia公司）操作按照Allin-One miRNA實時定量試劑盒（美國Genecopoeia公司）說明書進(jìn)行，miR-21/U6表示miR-21的相對表達(dá)量。以正常體檢者的miR-21含量作為對照組，對比分析ACI組血清miR-21的表達(dá)情況。

1.5 缺血性腦卒中復(fù)發(fā)標(biāo)準(zhǔn) ①原有的神經(jīng)缺失癥狀和體征好轉(zhuǎn)或消失后，再出現(xiàn)新的同側(cè)或?qū)?cè)的神經(jīng)功能缺損癥狀；②經(jīng)頭顱CT和（或）MRI檢查證實有新發(fā)病灶；③排除進(jìn)展性卒中或病情惡化所致；④排除因頸動脈支架術(shù)或血管成形術(shù)后并發(fā)缺血性卒中患者。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，其中正態(tài)分布的計量資料結(jié)果采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。IL-6、miR-21與其它指標(biāo)的相關(guān)性分析采用直線Spearman等級相關(guān)分析，取α=0.05為檢驗水準(zhǔn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 兩組的年齡、性別、飲酒史、高血壓及吸煙史未見明顯差異（P>0.05）。ACI組的TC、TG、LDL、Cr、AST、ALT平均數(shù)值均高于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。ACI組的HDL平均數(shù)值低于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。見表1。

2.2 兩組血清miR-21表達(dá)水平對比 采用實時定量PCR方法檢測對照組和ACI組發(fā)病后12h、1d、3d、5d、7d、14d外周血miR-21水平，對照組miR-21相對表達(dá)量個體之間存在差異，為1～16，平均為8.1±7.7。miR-21在發(fā)病后12h迅速升高，第1天和第3天miR-21表達(dá)量繼續(xù)維持較高水平。第5天開始逐漸下降，與對照組相比，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。第14天時miR-21表達(dá)量降至大致正常水平，與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），見表2。

表2 兩組血清miR-21/U6水平對比

2.3 兩組血清IL-6水平對比 ACI組患者血清IL-6水平在發(fā)病后第12h開始升高，第1天達(dá)到高峰，與對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。第3天略有下降，第5天下降明顯，第7天下降至（126.85±59.63）pg/ml，與對照組相比，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。第14天降至大致正常水平，與對照組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）。見表3。

表3 兩組血清IL-6水平對比（pg/ml）

2.4 兩組血清STAT3與IL-6水平變化趨勢對比ACI組血清STAT3水平在發(fā)病后第12h開始迅速升高，第1天達(dá)到高峰，與正常對照組相比有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。第3天開始逐漸下降，第7天和第14天降至大致正常水平。見表4。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ACI患者血清STAT3和IL-6隨時間變化趨勢一致。見圖1。

2.5 IL-6和miR-21/U6峰值水平與ACI復(fù)發(fā)的關(guān)系當(dāng)IL-6峰值小于250pg/ml時，ACI患者1年內(nèi)僅有1例復(fù)發(fā)。當(dāng)IL-6峰值水平顯著增高時，ACI復(fù)發(fā)的患者迅速增加，分別為15.8%和40.9%，發(fā)現(xiàn)IL-6水平越高，復(fù)發(fā)率越高。當(dāng)miR-21/U6峰值小于30時，ACI患者1年內(nèi)僅有2例復(fù)發(fā)。當(dāng)miR-21/U6峰值水平顯著增高時，ACI復(fù)發(fā)的患者迅速增加，分別為55.6%和50.0%，通過對不同的miR-21/U6表達(dá)水平分組，發(fā)現(xiàn)miR-21/U6水平越高，復(fù)發(fā)率越高。見表5、6。

表4 兩組血清STAT3水平對比（pg/ml）

圖1 ACI患者血清STAT3和IL-6水平隨時間變化趨勢

表5 ACI患者IL-6峰值水平與復(fù)發(fā)情況對比

表6 ACI患者miR-21/U6峰值水平與復(fù)發(fā)情況對比

3 討論

現(xiàn)階段，人民生活水平提高，高血壓、高血脂、糖尿病等基礎(chǔ)代謝疾病發(fā)病率升高，心腦血管疾病的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年上升趨勢。對老年人群的腦卒中生理及病理發(fā)病機(jī)制研究日漸深入。但腦卒中病情復(fù)雜多變，預(yù)后較差。其不僅發(fā)病率高、死亡率高，而且有過腦卒中病史的人群，再次發(fā)生心腦血管疾病的可能性較正常人高。腦卒中的治療已經(jīng)取得了長足進(jìn)步，患者預(yù)后得到了明顯改善。但已經(jīng)發(fā)生過腦卒中的患者，在未來5年內(nèi)，再次發(fā)生腦卒中的幾率接近1/5。故對既往腦卒中后患者以及社區(qū)高危人群進(jìn)行定期篩查，做好相應(yīng)的一級預(yù)防至關(guān)重要。如果患者不幸罹患了腦卒中，應(yīng)該在發(fā)病后及時進(jìn)行準(zhǔn)確診斷以及有效治療，這對腦卒中患者的預(yù)后至關(guān)重要。在治療過程中，應(yīng)該對患者病情準(zhǔn)確評估，及時、合理、有效地進(jìn)行溶栓等治療，能夠減輕患者痛苦，提高患者出院后的生活質(zhì)量。同時對患者存在的高血壓、高血糖、高血脂、動脈粥樣硬化等不良預(yù)后指標(biāo)進(jìn)行有效監(jiān)控，可以明顯降低腦卒中發(fā)病率、改善腦卒中患者預(yù)后[4]。腦卒中的發(fā)病過程十分復(fù)雜，顱腦生理結(jié)構(gòu)及對應(yīng)的功能復(fù)雜，若腦卒中發(fā)病過程中大腦的錐體束受累，會導(dǎo)致機(jī)體運(yùn)動神經(jīng)元異常。神經(jīng)細(xì)胞不可再生，損傷后難以修復(fù)，腦卒中患者發(fā)生一系列的神經(jīng)結(jié)構(gòu)異常后，即使患者經(jīng)過有效治療后出院，其神經(jīng)功能也難以恢復(fù)到正常，導(dǎo)致腦卒中患者神經(jīng)損傷后致殘率較高，生活質(zhì)量差，進(jìn)而造成沉重的家庭和社會負(fù)擔(dān)。

腦卒中的發(fā)生是一個急性過程，但其誘因的積累是一個慢性過程。血管動脈粥樣硬化是一種常見的系統(tǒng)性疾病，且越來越年輕化，動脈粥樣硬化是影響老年患者心腦血管疾病的常見問題之一。其會導(dǎo)致血管狹窄，甚至血管閉塞，例如，冠狀動脈粥樣硬化的患者其心絞痛、心肌梗死的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常人。因此動脈硬化是腦卒中發(fā)病率、致殘率、致死率高的重要因素之一。隨著社會發(fā)展，生活水平的提高，人們不良的生活習(xí)慣以及生活環(huán)境是腦卒中發(fā)病率逐年升高的重要原因。腦卒中起病往往比較急驟，常常因為患者家庭距離醫(yī)院較遠(yuǎn)，送醫(yī)不夠及時，入院后診斷不明確，治療不及時等一系列問題，導(dǎo)致預(yù)后不良。

通過分析腦卒中的發(fā)病人群情況，發(fā)現(xiàn)老年人居多，且患者糖尿病、高血壓，甚至惡性腫瘤等基礎(chǔ)疾病多。本研究發(fā)現(xiàn)，ACI組和對照組的年齡、性別、飲酒史、高血壓及吸煙史未見明顯差異。高血壓和吸煙可能與ACI有關(guān)，但本研究入組例數(shù)較少，暫時無統(tǒng)計學(xué)差異。進(jìn)一步分析，ACI患者的TC、TG、LDL、AST、ALT平均數(shù)值均高于正常對照組，HDL平均數(shù)值低于對照組，但無統(tǒng)計學(xué)差異。ACI患者的HDL平均數(shù)值低于正常對照組。本研究進(jìn)一步證實了ACI患者血脂普遍高于正常人，部分患者出現(xiàn)肝臟損害，但由于入組的患者例數(shù)較少，無統(tǒng)計學(xué)差異。如果腦卒中患者合并高血壓、糖尿病等疾病，其血管條件較差，粥樣硬化的情況與發(fā)病和預(yù)后具有較強(qiáng)的相關(guān)性，血管粥樣硬化嚴(yán)重的腦卒中患者，其預(yù)后往往較差。因此，對于腦卒中的高危人群，需要進(jìn)行科普教育，嚴(yán)格低鹽低脂飲食，進(jìn)行系統(tǒng)性藥物降脂和穩(wěn)定血管斑塊的治療。腦卒中的研究對于預(yù)防、治療以及預(yù)后顯得尤其重要，近來，有許多學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)，炎性相關(guān)的細(xì)胞因子作為一種重要的遞質(zhì)在腦卒中發(fā)生、發(fā)展及疾病的轉(zhuǎn)歸中起到了重要作用，它們可能影響到腦血管病的進(jìn)展、嚴(yán)重程度及最后轉(zhuǎn)歸。

近些年來，在腦卒中的研究中，細(xì)胞免疫、體液免疫等免疫微環(huán)境的研究很多，炎性相關(guān)的研究逐步衍生出免疫炎性反應(yīng)概念。炎癥因子可以通過刺激B淋巴細(xì)胞，使其大量增殖分化，同時還可以導(dǎo)致單核巨噬細(xì)胞被過度激活。單核巨噬細(xì)胞在免疫反應(yīng)的過程中，能夠通過變形發(fā)揮吞噬抗炎作用。部分腦卒中患者的副交感神經(jīng)在經(jīng)過刺激后，能夠呈現(xiàn)出過度活躍的狀態(tài)。這些被激活的副交感神經(jīng)能釋放乙酰膽堿，發(fā)揮抑制巨噬細(xì)胞釋放TNF-α，IL-6等促炎因子。在收入我院的腦卒中患者中，通過對血清炎性反應(yīng)因子水平進(jìn)行檢測，能夠發(fā)現(xiàn)很多對應(yīng)的炎性因子分泌隨之增高。例如，白細(xì)胞介素類因子升高最為明顯，是目前研究最多，也是機(jī)制較為清晰的常見炎癥因子。其中IL-6是炎癥反應(yīng)過程中的主要因子，是一種重要的炎癥相關(guān)細(xì)胞因子，在腦卒中患者中發(fā)揮了重要的免疫調(diào)節(jié)作用。IL-6能夠作為一種重要的遞質(zhì)，通過調(diào)控下游的靶向分子，在腦卒中發(fā)生、發(fā)展及疾病的轉(zhuǎn)歸中起到重要作用[1]。我們大膽的推測，血清中IL-6的檢測可以作為一種預(yù)測病情進(jìn)展和預(yù)后轉(zhuǎn)歸的一項重要指標(biāo)，判斷患者在腦卒中期間的感染情況，以及制定相應(yīng)的治療方案。在腦卒中的發(fā)生發(fā)展過程中，炎癥相關(guān)細(xì)胞及因子參與其中。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，患者在發(fā)生腦卒中后，血液中的淋巴細(xì)胞參與其炎性介導(dǎo)的浸潤過程，其中T淋巴細(xì)胞能夠發(fā)揮促分泌作用，能夠產(chǎn)生大量的促炎性細(xì)胞因子。這些炎癥因子能夠進(jìn)一步促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖和分化。IL-6、IL-8、IL-17等炎癥因子不僅能夠作用于B細(xì)胞，而且還能激活單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞發(fā)揮吞噬作用。同時，在患者發(fā)生腦卒中后，會產(chǎn)生大量的壞死組織，這些組織一定程度上會釋放大量的細(xì)胞因子，提高了血液循環(huán)中的含量，同時能夠刺激下丘腦-垂體-腎上腺軸產(chǎn)生沖動，而中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮能夠進(jìn)一步促進(jìn)交感神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮交感作用。同時腦卒中發(fā)生過程中炎癥因子的變化，也會影響機(jī)體的免疫微環(huán)境，發(fā)揮正反饋作用，進(jìn)一步加快炎性反應(yīng)過程。上述研究結(jié)果進(jìn)一步表明，腦卒中的炎性反應(yīng)過程是促炎因子和抑炎因子相關(guān)作用的過程，也是一個動態(tài)平衡的過程。深入研究發(fā)現(xiàn)，不同卒中患者，其體內(nèi)炎性反應(yīng)水平存在差異。卒中病情越嚴(yán)重，血清炎性反應(yīng)因子水平越高，動態(tài)平衡呈現(xiàn)促炎發(fā)展[5]。卒中病情輕微的患者，血清炎性反應(yīng)因子水平越低。腦卒中患者的炎性細(xì)胞因子水平與預(yù)后是否相關(guān)需要進(jìn)一步的臨床觀察以及實驗研究。

本研究中炎性因子是主要的監(jiān)測對象，其中IL-6是一種重要的炎癥相關(guān)的細(xì)胞因子，其作為一種重要的遞質(zhì)在腦卒中發(fā)生、發(fā)展及疾病的轉(zhuǎn)歸中起到了重要的作用[6]，可能影響到腦血管病的病情進(jìn)展、嚴(yán)重程度及最后的轉(zhuǎn)歸[3]。本研究通過分析IL-6的表達(dá)水平與ACI復(fù)發(fā)的關(guān)系。當(dāng)IL-6峰值小于250pg/ml時，ACI患者1年內(nèi)僅有1例復(fù)發(fā)。當(dāng)IL-6峰值水平顯著增高時，ACI復(fù)發(fā)的患者迅速增加，通過不同的IL-6表達(dá)水平分組，發(fā)現(xiàn)IL-6水平越高，復(fù)發(fā)率越高。因此我們將血清中IL-6水平作為預(yù)測病情進(jìn)展和預(yù)后轉(zhuǎn)歸的一項重要指標(biāo)，可以更好地判斷患者在腦卒中期間的感染情況，以及制定相應(yīng)的治療方案。

目前研究顯示，microRNAs可以單獨發(fā)揮調(diào)控作用，也可以兩個有著共同的作用靶點的microRNAs作為一個群體，協(xié)同發(fā)揮調(diào)控作用。目前mRNA在不同的疾病中的表達(dá)會存在差異，通過轉(zhuǎn)錄后水平的變化差異，調(diào)控其目的基因差異表達(dá)水平。這些microRNAs能夠通過特定的途徑，參與細(xì)胞分化、凋亡及增殖等機(jī)體各種生物學(xué)行為的調(diào)控。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)microRNAs作用十分廣泛，例如microRNA-21（miR-21）在多種心血管疾病中的表達(dá)均增加，參與疾病的發(fā)生發(fā)展，并且在多種惡性腫瘤中，miR-21還能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和分化等，造成腫瘤器官內(nèi)轉(zhuǎn)移以及全身腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散。急性腦梗死時，腦部的組織和細(xì)胞發(fā)生缺血缺氧反應(yīng)，而后細(xì)胞壞死、凋亡，細(xì)胞膜及血腦屏障通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞中的microRNAs釋放入血并能在血液中存在一段時間。miR-21在多種心血管疾病中的表達(dá)均增加，并參與了細(xì)胞增殖和分化等過程[7]。miR-21的作用機(jī)制已經(jīng)有了一定的研究，研究發(fā)現(xiàn)miR-21可通過下調(diào)PDCD4的表達(dá)來促進(jìn)細(xì)胞增殖[8，9]。另外，miR-21的過表達(dá)可以抑制正常細(xì)胞凋亡信號傳導(dǎo)，因此抑制miR-21可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)在腦卒中的患者血清miR-21的表達(dá)明顯上調(diào)，但miR-21參與腦卒中的機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。本研究顯示：當(dāng)miR-21/U6峰值小于30時，ACI患者1年內(nèi)僅有2例復(fù)發(fā)；當(dāng)miR-21/U6峰值水平顯著增高時，ACI復(fù)發(fā)的患者迅速增加。通過不同的miR-21/U6表達(dá)水平分組，發(fā)現(xiàn)miR-21/U6水平越高，復(fù)發(fā)率越高。miR-21可能作為一種預(yù)測患者病情發(fā)展和短時間復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)。通過學(xué)習(xí)文獻(xiàn)，我們推測miR-21在腦卒中發(fā)展過程中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用。miR-21在一定程度上可以調(diào)控STAT3的表達(dá)[10]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-21和IL-6的峰值越高，ACI患者復(fù)發(fā)率越高，兩者趨勢一致，這進(jìn)一步證實miR-21通過調(diào)控STAT3來作用于IL-6的表達(dá)，兩者與ACI患者的復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

綜上所述，血清中IL-6在患者炎癥發(fā)生發(fā)展起到了至關(guān)重要的作用，通過對其的檢測可以預(yù)測患者的卒中復(fù)發(fā)情況，為制定診療方法提供一定的依據(jù)，同時miR-21的檢測可能為預(yù)后評估提供參照。血清IL-6和miR-21的檢測或許能成為腦卒中患者的常規(guī)性的檢查指標(biāo)之一，為提示病情進(jìn)展，制定診療方案，預(yù)測患者復(fù)發(fā)提供依據(jù)。