結(jié)核病是由人類特有的胞內(nèi)病原體—結(jié)核分枝桿菌引起的，并通過呼吸道在人與人之間傳播的一種慢性傳染性疾病。結(jié)核分枝桿菌具有特殊的細胞壁結(jié)構(gòu)，含豐富的脂質(zhì)，對外界環(huán)境和藥物有很強的抵御能力。細胞內(nèi)生長的結(jié)核分枝桿菌致病機制已經(jīng)研究得很透徹，而胞外生長的結(jié)核分枝桿菌引起的病理變化則很少涉及[1～3]。長期以來，人們圍繞結(jié)核病免疫相關(guān)的T淋巴細胞（尤其是CD4+的Th1細胞）、巨噬細胞和樹突狀細胞（dendritic cells，DC）進行了大量研究，并取得了一些進展。目前，多數(shù)研究者肯定的觀點是，Th1型免疫應(yīng)答在結(jié)核病的適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，是介導(dǎo)結(jié)核病保護性免疫的主要群體；巨噬細胞作為機體抗MTB感染的主要免疫效應(yīng)細胞，在結(jié)核病的保護性免疫應(yīng)答中也發(fā)揮著重要作用。但是，對于參與結(jié)核病免疫的另一個重要細胞群體，也是MTB感染后最先由外周血遷移至感染病灶的細胞—中性粒細胞的研究卻明顯滯后[4]。本研究擬通過結(jié)核分枝桿菌和卡介苗誘導(dǎo)中性粒細胞形成NETs（neutrophil extracellular traps）結(jié)構(gòu)，探討中性粒細胞在結(jié)核感染過程中所扮演的角色，揭示卡介苗預(yù)防結(jié)核分枝桿菌感染的可能機制。

1 材料與方法

1.1 材料 結(jié)核分枝桿菌國際標(biāo)準(zhǔn)株、BCG菌種由北京結(jié)核病胸部腫瘤研究所提供，胎牛血清（FBS）、RPMI-1640、Middlebrook 7H9培養(yǎng)基購自美國Sigma公司，Sytox? Green 試劑盒購自美國Eugene公司，人中性粒細胞提取試劑盒購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，抗-H3Cit、抗-MPO抗體購自Abcam公司，Quant-iTTMPicoGreen ? dsDNA Reagent and Kits購自ThermoFisher公司。人外周血標(biāo)本來自本院健康體檢志愿者，無外傷、感染病史，HBV、HCV、HIV均陰性，并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng) 取標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv和BCG接種于5ml無菌7H9液體培養(yǎng)基中，37℃搖床恒溫箱中培養(yǎng)3～4周，搖床速度為100～120轉(zhuǎn)/h，吸取100μl菌液接種于5ml新鮮7H9液體培養(yǎng)，繼續(xù)搖床培養(yǎng)7～10d。取菌液100μl重懸于PBS中，調(diào)整至麥?zhǔn)蠞舛?.5。

1.2.2 中性粒細胞分離 取10ml離心管一支，將健康志愿者EDTA抗凝血4ml小心加到4ml中性粒細胞分離液之上。3 000r/min，水平離心30min，離心后吸取中性粒細胞層后加入紅細胞裂解液，充分裂解后離心，3 000r/min，30min后取中性粒細胞層加入PBS洗滌。用含5%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸后進行細胞計數(shù)。

1.2.3 NETs誘導(dǎo) 加入0.5ml中性粒細胞重懸液（含細胞數(shù)4×105個）于24孔細胞培養(yǎng)板，放入多聚賴氨酸處理的無菌玻片，5%的CO2培養(yǎng)箱中1h靜置處理細胞，對照組、MTB組、BCG組分別加入PBS、MTB、BCG各0.5ml，各組設(shè)平行3組。5% 的CO2培養(yǎng)箱中3h后收集細胞上清，用于檢測游離DNA。各孔加入0.5ml 4%多聚甲醛，4℃固定過夜，用于免疫熒光染色。

1.2.4 NETs檢測 免疫熒光染色：從6孔板中取出細胞爬片，PBS洗滌3次，0.5%Triton X-100透化1min，PBS洗滌3次，加入5%FBS于37℃濕盒中封閉30min。加入一抗（抗-H3Cit 1∶400，抗-MPO 1∶400）于37℃濕盒中封閉1h。PBS洗滌3次后加入二抗（抗-H3Cit 1∶1000，抗-MPO 1∶1000）于37℃濕盒中封閉1h。PBS洗滌3次后加入DAPI避光染色10min，加封片劑封片。激光共聚焦顯微成像儀檢測NETs。

1.2.5 游離DNA定量檢測 按Quant-iTTMPicoGreen ?dsDNA Reagent and Kits試劑盒說明書進行操作，倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，激發(fā)光波長480nm，發(fā)射光波長520nm，熒光檢測儀檢測熒光信號并記錄結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NETs的激光共聚焦顯微成像 激光共聚焦顯微成像分析發(fā)現(xiàn)：中性粒細胞在BCG和MTB的刺激下，可見絲狀或環(huán)狀DNA骨架結(jié)構(gòu)，H3Cit和MPO附著于DNA骨架結(jié)構(gòu)上。中性粒細胞的體積增大，且產(chǎn)生環(huán)狀或絲狀骨架結(jié)構(gòu)的細胞比例增多。BCG組和MTB組標(biāo)記H3Cit和MPO顆粒物的熒光強度較對照組明顯增強，即DNA骨架結(jié)構(gòu)上附著的H3Cit和MPO顆粒數(shù)量增多，見圖1。

圖1 NETs免疫熒光染色

2.2 游離DNA含量 中性粒細胞經(jīng)BCG和MTB刺激后，上清中游離DNA含量較對照組顯著增高（P<0.05），MTB刺激組游離DNA含量明顯高于BCG刺激組（P<0.05）。該結(jié)果與免疫熒光染色結(jié)果一致，證明中性粒細胞經(jīng)BCG和MTB刺激可形成NETs，且MTB刺激效率明顯強于BCG，見圖2。

圖2 游離DNA含量

3 討論

盡管中性粒細胞占外周循環(huán)白細胞數(shù)量的50%～80%，但其吞噬作用一直被低估，免疫學(xué)的研究重點主要集中在單核吞噬細胞如單核細胞和巨噬細胞。中性粒細胞通過直接吞噬細菌、脫顆粒及細胞因子的分泌，如腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1（IL-1）來發(fā)揮先天性免疫作用。2004年Brinkmann等[5]首先報道了中性粒細胞活化后會在胞外形成類似網(wǎng)狀的結(jié)構(gòu)—中性粒細胞胞外捕獲網(wǎng)，并認為這是中性粒細胞發(fā)揮先天性免疫作用的一種重要機制。NETs由雙鏈DNA的骨架結(jié)構(gòu)和具有抗菌活性的蛋白質(zhì)：髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、組蛋白和中性粒細胞彈性蛋白酶（neutrophilelastase，NE）等組成。病原微生物（包括結(jié)核分枝桿菌）、多種促炎因子（IL-8、TNF-α等）、活化血小板、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和乙酸肉豆蔻佛波酯（phorbolmyristateacetate，PMA）等多種生物化學(xué)因子均可以刺激中性粒細胞NETs形成[5]。NETs是血漿中游離DNA（cell-free DNA，cf DNA）的重要來源，因此有研究認為檢測血漿中cf DNA濃度可以作為反映NETs形成的一種方式[6]。目前主要有3種方法通過檢測NETs組分用于NETs的檢測[7]：①檢測NETs的DNA骨架結(jié)構(gòu)，通過SYTOX染色的方式進行檢測，這種染料可以直接插入游離的DNA中且不會對活細胞產(chǎn)生影響；②通過免疫熒光染色檢測NETs組分髓過氧化物酶和組蛋白H3Cit，用來區(qū)分核DNA與細菌、線粒體DNA的組蛋白；③檢測中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）濃度來反映NETs的水平。本研究通過免疫熒光染色檢測NETs組分MPO和H3Cit及檢測cf DNA證實MTB和BCG能夠在體外誘導(dǎo)NETs形成并建立成熟的誘導(dǎo)方法。

結(jié)核分枝桿菌是逃避免疫系統(tǒng)最成功的胞內(nèi)病原體之一，主要感染呼吸系統(tǒng)，但也可能影響其他器官，與其他致病菌不同的是不產(chǎn)生毒素。由于結(jié)核分枝桿菌屬于胞內(nèi)感染，細胞外的中性粒細胞在結(jié)核病中可能扮演的角色被忽略。中性粒細胞可以分泌活性氧（ROS）、彈性蛋白酶、膠原蛋白酶和髓過氧化物酶，通過這些物質(zhì)以一種非選擇性的方式直接殺滅結(jié)核分枝桿菌和受感染的宿主細胞或者通過調(diào)節(jié)早期炎癥反應(yīng)增強巨噬細胞對結(jié)核桿菌的清除能力，這些對于控制結(jié)核感染至關(guān)重要[8，9]。結(jié)核分枝桿菌利用吞噬細胞復(fù)制，也作為傳播至整個宿主生物體的一種方式。中性粒細胞聯(lián)合巨噬細胞可以有效地抑制結(jié)核感染，并有助于早期肉芽腫形成[10]。肉芽腫是一種由免疫細胞組成的結(jié)構(gòu)，用于應(yīng)對原發(fā)性感染。結(jié)核分枝桿菌通過增加中性粒細胞的凋亡以阻止其產(chǎn)生肉芽腫來包裹這些細菌，凋亡中性粒細胞的胞葬作用導(dǎo)致免疫應(yīng)答向促炎方向轉(zhuǎn)化。不同基因型的結(jié)核分枝桿菌都可誘導(dǎo)中性粒細胞形成NETs。NETs 能夠有效地捕獲侵入的分枝桿菌，隔離有毒物質(zhì)以保護周圍組織免受損害，但無法殺滅捕獲的結(jié)核分枝桿菌[11，12]。

大量的體內(nèi)和體外試驗研究證實中性粒細胞具有吞噬結(jié)核分枝桿菌的能力。在小鼠感染BCG或MTB一天后，中性粒細胞聚積在小鼠肺組織和呼吸道中，其中1.6%的中性粒細胞內(nèi)含有結(jié)核分枝桿菌[13]。在體外分離的感染結(jié)核分枝桿菌的人肺組織中，大約7%的感染細胞是中性粒細胞[14，15]。而關(guān)于中性粒細胞殺死結(jié)核分枝桿菌的數(shù)據(jù)相互矛盾。有研究發(fā)現(xiàn)中性粒細胞的抗細菌活性較差，即使被IFN-γ刺激（能夠激活巨噬細胞的抗菌性能），抗細菌活性也沒有明顯增強[13，16]。而另外的研究報道中性粒細胞和中性粒細胞衍生的殺菌分子確實能在體外殺死結(jié)核分枝桿菌[17，18]。中性粒細胞對MTB的殺傷能力較差，這使得一些研究者認為它們隱藏著結(jié)核分枝桿菌，從而逃避巨噬細胞的殺傷作用[19]。另一方面，中性粒細胞增加了巨噬細胞的殺菌活性：巨噬細胞吞噬凋亡的中性粒細胞，并利用其殺菌肽對抗細胞內(nèi)MTB[20]。部分中性粒細胞的殺菌活性是由中性粒細胞胞外捕獲網(wǎng)介導(dǎo)的，中性粒細胞經(jīng)MTB刺激能釋放含有中性粒細胞彈性酶和組蛋白的胞外捕獲網(wǎng)，但不能殺死MTB[21]。此外，有人認為胞外捕獲網(wǎng)可能為細胞外結(jié)核的生長提供了一個平臺，從而有助于迅速擴大肺部病變[22]。另外中性粒細胞胞外捕獲網(wǎng)可通過降低T細胞的活化閾值直接激活T細胞[23]。熱休克蛋白72（HSP-72）對消除結(jié)核分枝桿菌具有重要作用，HSP-72存在于凋亡細胞和壞死細胞中，同時在NETs內(nèi)的DNA也被發(fā)現(xiàn)，這些對于遏制和消除結(jié)核分枝桿菌具有重要意義[24]。

綜上所述，關(guān)于中性粒細胞是否能夠殺死MTB存在很大爭議。這些具有極高殺菌潛力的中性粒細胞及NETs對分枝桿菌是否有明確的殺菌作用，還有待進一步研究探討。