前列腺癌(PCa)是男性中 診斷率居第二位的癌癥,也是全世界第五大最常見的男性死亡原因。近年來,雖然對(duì)前列腺癌診斷和治療的研究取得了很大進(jìn)展,但前列腺癌的發(fā)病率和死亡率仍然很高[1]。前列腺癌生存率低的主要原因之一是其機(jī)制尚不清楚,缺乏有效的治療。因此,有必要揭示前列腺癌的分子機(jī)制,尋找治療前列腺癌的潛在靶點(diǎn)。
miRNAs是一類高度保守的非編碼小RNA分子,不僅參與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝,而且參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[2,3]。它在各種疾病的發(fā)生和發(fā)展中也起著至關(guān)重要的作用。此外,miRNAs的異常是由于基因丟失和突變、表觀基因過度表達(dá)或沉默以及腫瘤轉(zhuǎn)錄因子活性異常所致[4]。大量研究表明,miRNAs在胃癌[5]、膀胱癌[6]、乳腺癌[7]和骨肉瘤[8]等多種惡性腫瘤中具有癌基因或抑癌基因的作用。然而,大多數(shù)miRNAs在前列腺癌中的表達(dá)和功能尚不清楚。
最近有研究證明,miR-144-3p在胰腺癌[9]、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤[10]、胃癌[11]等癌癥中起著抑癌作用。然而,該基因在PCa中的表達(dá)和作用尚未明確。富含脯氨酸的蛋白質(zhì)11(PRR11)位于染色體17q22上,編碼360-氨基酸蛋白質(zhì)。生物信息學(xué)分析表明PRR11含有2個(gè)富含脯氨酸的區(qū)域和1個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域[12]。通過靶基因預(yù)測軟件miRanda、Target Scan 6.2顯示,miR-144與PRR11有著密不可分的關(guān)系。
1.1 主要試劑和抗體 細(xì)胞LNCaP細(xì)胞株購自東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院泌尿外科研究所。培養(yǎng)于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中,胎牛血清、1640 培養(yǎng)基、0.2 5%胰蛋白酶購于美國Gibco公司,細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)、結(jié)晶紫染色液、BCA 蛋白濃度檢測試劑盒購于中國碧云天生物技術(shù)研究所,PRR11抗體、β-actin抗體、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈凡益試劑盒購自美國 Promega 公司,miR-144模擬物(miR-144 mimics)和陰性對(duì)照(miR-NC)購自上海吉瑪公司。
1.2 實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈(RT-qPCR)法 用Trizol試劑從培養(yǎng)細(xì)胞中提取總RNA,并檢驗(yàn)其純度和濃度按照反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)說明書操作,以U6作為內(nèi)參,根據(jù)試劑說明書設(shè)定反應(yīng)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn),所有計(jì)算值均采用2-ΔΔCT表達(dá)mRNA相對(duì)表達(dá)量。
1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中,用含有10%胎牛血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人前 列腺癌LNCaP細(xì)胞株。取生長良好,融合60%~80%的細(xì)胞,按Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書分別將miR-144和miR-NC轉(zhuǎn)染到 LNCaP細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。
1.4 CCK-8法檢測LNCaP細(xì)胞增殖能力 選擇狀態(tài)良好、處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞,分別轉(zhuǎn)染miR-144和miR-NC 后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)染48h后,將2 000個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中,分為24、48、72、96h組,每組分別設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,每孔分別加入10μl CCK-8試劑,繼續(xù)在37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育1h,用酶標(biāo)儀檢測每孔的OD 值,吸收波長450nm。
1.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 選取轉(zhuǎn)染后生長良好的細(xì)胞,在24孔板中加入600μl完全培養(yǎng)基,取100μl無血清含2×104細(xì)胞懸液種植于Transwell小室的上室,每組3個(gè)復(fù)孔。將上室置于下室中,將小室放在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8~14h后取出上室,用95%甲醇固定細(xì)胞15min后風(fēng)干小室,再用0.2%結(jié)晶紫染色20min,每個(gè)小室隨機(jī)取5個(gè)200倍鏡視野。
1.6 Western blot實(shí)驗(yàn) 將轉(zhuǎn)染過48h的細(xì)胞,用細(xì)胞及裂解液裂解細(xì)胞并提取蛋白,測定蛋白后繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。每個(gè)樣品中的蛋白質(zhì)70V電壓SDSPAGE凝膠電泳30min,然后調(diào)節(jié)為110V繼續(xù)電泳80min,切膠,以200mA轉(zhuǎn)膜2h。用5%脫脂牛奶在Tris-HCl緩沖液中封閉,并在一抗孵育過夜。在TBST中洗滌3次后,在二抗中孵育2h。用ECL法顯示條帶。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理,所有數(shù)值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組之間比較采用t檢驗(yàn),當(dāng)P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,所有的數(shù)據(jù)來自3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
2.1 兩組轉(zhuǎn)染后LNCaP中miR-144相對(duì)表達(dá)量比較 分別提取轉(zhuǎn)染過miR-NC和轉(zhuǎn)染過miR-144細(xì)胞RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。miR-144組表達(dá)量明顯高于miR-NC組(1494±94.63 vs 0.8733±0.1157,P<0.0001),見圖1A。
2.2 兩組抑制前列腺癌細(xì)胞株LNCaP增殖能力比較 與轉(zhuǎn)染miR-NC組相比,轉(zhuǎn)染miR-1 44組明顯抑制前列腺癌LNCaP細(xì)胞株增殖能力(P<0.01)。見圖1B。
2.3 兩組抑制前列腺癌細(xì)胞株LNCaP遷移能力比較 過表達(dá)miR-144之后LNCaP細(xì)胞體外遷移能力與轉(zhuǎn)染miR-NC細(xì)胞相比顯著降低(143.0±6.351 vs 196.0±16.20,P=0.0382),見圖1C。
2.4 miR-144調(diào)控前列腺癌LNCaP細(xì)胞株中PRR11的表達(dá) 采用靶基因預(yù)測軟件miRanda、Target Scan 6.2等,結(jié)合文獻(xiàn),預(yù)測PRR11是miR-144的潛在下游靶基因:PRR11 3'UTR-WT:5'-GUAUGGAGCC CACACAUACUGUG-3';miR-144-3P:3'-UCAUGUA GUAGAUAUGACAU-5';PRR11 3'UTR-MUT:5'-GUAUGGAGCCCACACAGCAACUG-3'。在前列腺癌細(xì)胞株LNCaP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-144 mimics及miR-NC后,根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法中的操作步驟,分別提取兩組細(xì)胞的蛋白,測定蛋白濃度后進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明過表達(dá)miR-144后,LNCaP細(xì)胞中PRR11的表達(dá)量顯著下降(P=0.030),miR-144與PRR11呈負(fù)向調(diào)控關(guān)系。見圖2。
圖1 miR-144體外抑制前列腺癌細(xì)胞LNCaP增殖和遷移
圖2 miR-144抑制前列腺癌細(xì)胞株LNCaP中PRR11相對(duì)表達(dá)量
前列腺癌的發(fā)病率在美國已經(jīng)超過肺癌,成為首位危害男性健康的腫瘤,占男性腫瘤發(fā)病率的28%。據(jù)美國癌癥協(xié)會(huì)的估計(jì),2011年美國有240 890新發(fā)病例,有33 720人死于前列腺癌[13]。miRNAs在多種腫瘤細(xì)胞中起關(guān)鍵作用,包括腫瘤生長、凋亡和腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移,可作為癌基因或抑癌基因[14,15]。此外,應(yīng)用不同miRNAs在血漿、血清和腫瘤標(biāo)本中的表達(dá)譜對(duì)人類癌癥進(jìn)行了準(zhǔn)確分類,提示miRNAs可能是診斷人類癌癥和患者預(yù)后的生物標(biāo)志物[16]。這些結(jié)果都證明miRNAs對(duì)腫瘤的發(fā)生有著重要作用,迫切需要我們揭示miRNAs在前列腺癌進(jìn)展過程中的作用機(jī)制。有研究表明,很多miRNAs可參與前列腺癌進(jìn)展過程。Guan等[17]報(bào)道,miR-218在前列腺癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)下調(diào),并且通過直接靶基因Gli1抑制前列腺癌細(xì)胞的遷移、上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換。Hu等[3]發(fā)現(xiàn)miR-212通過調(diào)控MAPK1抑制前列腺癌細(xì)胞增殖和侵襲。同時(shí),Mushtaq等[11]報(bào)道,miR-144通過下調(diào)AP4抑制胃癌細(xì)胞增殖和侵襲。
據(jù)報(bào)道,PRR11在癌癥發(fā)展中起重要作用,Zhou等[12]研究表明在ESCC細(xì)胞株中PRR11的mRNA和蛋白水平顯著高于NEECs,同時(shí)過表達(dá)的PRR11促進(jìn)食管鱗狀細(xì)胞癌的成瘤能力,并與食管鱗狀細(xì)胞癌的進(jìn)展有關(guān)。另外,Qiao等[18]研究結(jié)果說明敲除PRR11可以 通過β-catenin信號(hào)通路抑制肝細(xì)胞癌生長和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。
本研究結(jié)果顯示,miR-144通過下調(diào)PRR11抑制前列腺癌細(xì)胞株LNCaP增殖、遷移。說明miR-144在前列腺癌發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的抑制作用,此作用可能與PRR11的表達(dá)有著密不可分的關(guān)系。