張 鑫 李彥松 韓 睿 蔣艷艷 劉哲涵

1(南陽師范學(xué)院，生命與科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南陽473061)2(北京理工大學(xué)，生命學(xué)院，北京100081)

1 引 言

雙酚A(Bisphonel A，BPA)作為一種化工原料，廣泛用于聚碳酸酯塑料和環(huán)氧樹脂的制造生產(chǎn)，也常用于食品、飲料、塑料奶瓶等生活消費(fèi)品的包裝內(nèi)襯[1,2]。研究表明，BPA是一種環(huán)境雌激素，食品、飲料容器中的微量BPA會(huì)通過降解擴(kuò)散至水及土壤中，通過生物富集到人體中，導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)，誘發(fā)疾病以及新陳代謝紊亂，給人體健康帶來極大危害[3～5]。目前，用于檢測(cè)微量BPA殘留的方法主要有電化學(xué)法[6]、高效液相色譜法[7]、生化傳感器[8]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[9]等。這些方法成本較高、檢測(cè)過程需要經(jīng)過采樣、預(yù)處理、提取、衍生化、純化等過程，需要復(fù)雜而精密的設(shè)備和專業(yè)培訓(xùn)的操作人員，耗時(shí)耗力，不便于野外考察以及現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。雙氰胺(Dicyandiamide，DCD)是一種有機(jī)化工原料，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中常作為硝化抑制劑添加到復(fù)合肥中，防止土地中的氮流失，促進(jìn)牧草生長(zhǎng)[10]。然而，水土中的DCD會(huì)殘留在牧草中，奶牛食用后會(huì)導(dǎo)致乳制品中微量的DCD殘留，對(duì)嬰幼兒的健康有著潛在的危害[11]。DCD分析技術(shù)需要復(fù)雜的樣品前處理過程和精密儀器，檢測(cè)成本高，操作復(fù)雜，不便于操作和推廣使用[12～14]。因此，有必要開發(fā)出操作簡(jiǎn)單、攜帶方便、能快速準(zhǔn)確地測(cè)定BPA以及DCD的檢測(cè)方法。

光子晶體(Photonic crystals，PCs)是一種可以由人工設(shè)計(jì)和制備的，在光學(xué)尺度上具有周期性介電結(jié)構(gòu)的晶體材料[15～17]。分子印跡技術(shù)(Molecular imprinting technique，MIT)是一種模擬抗原和抗體的特異性結(jié)合，人工構(gòu)建與目標(biāo)物在大小、形狀、功能基團(tuán)互補(bǔ)結(jié)合的聚合物技術(shù)[18]。采用對(duì)應(yīng)的洗脫體系對(duì)聚合物上的模板分子的洗脫，可得到與模板分子互補(bǔ)匹配的分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymer, MIP)。在適合的條件下，此印跡空穴可選擇性捕獲模板分子，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的特異識(shí)別和分離檢測(cè)。因此，將光子晶體與分子印跡聚合物結(jié)合，可以構(gòu)建出同時(shí)兼具分子印跡聚合物和光子晶體的優(yōu)點(diǎn)的分子印跡反蛋白石光子晶體聚合物(Molecularly imprinted inverse-opal photonic crystal polymers，MIPPs)?；诜肿佑≯E作用，MIPPs可以特異結(jié)合模板分子，引起MIPPs上的空穴結(jié)構(gòu)改變，使其衍射峰發(fā)生位移甚至結(jié)構(gòu)色產(chǎn)生明顯的變化。因此，這種材料可以作為傳感元件，用于特定物質(zhì)的光學(xué)分析檢測(cè)，具有操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)快速、靈敏性和選擇性高等優(yōu)點(diǎn)[19～22]。

目前，已有很多關(guān)于 MIPPs應(yīng)用的報(bào)道[23～27]，但對(duì)BPA和DCD的檢測(cè)研究不多且集中在單一物質(zhì)檢測(cè)[28～30]，而利用MIPPs作為傳感元件同時(shí)對(duì)實(shí)際樣品中兩種物質(zhì)傳感分析的應(yīng)用更少。本研究設(shè)計(jì)開發(fā)了基于BPA、DCD的 MIPPs的陣列傳感器，以期建立一種快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、成本低廉的檢測(cè)方法，用于環(huán)境水樣、食品中微量BPA和DCD的快速檢測(cè)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

SB-5200DTD超聲波清洗儀(寧波新芝生物科技股份有限公司)；Specord高精密紫外-可見分光光度計(jì)(德國(guó)耶拿公司)；中興101恒溫鼓風(fēng)干燥器(北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；Sigma 500/VP場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡(德國(guó)卡爾蔡司公司)；NovaNano 430掃描電子顯微鏡(美國(guó)FEI公司)。

DCD、丙烯酰胺購自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BPA、偶氮二異丁氰(AIBN)、甲基丙烯酸(MAA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)購自上海阿拉丁生物化學(xué)技術(shù)有限公司；無水甲醇、無水乙醇、乙腈、濃H2SO4、H2O2(30%)、HF(≥40%)等試劑購自北京化工廠。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 膜基質(zhì)的準(zhǔn)備將清洗后的玻片裁為 75 mm×10 mm大小，置于Piranha溶液(98% H2SO4-30% H2O2，7∶3，V/V)中浸泡 12 h，用水洗滌干凈后用氮?dú)獯蹈伞Ａ韺⒕奂谆┧峒柞?PMMA)裁剪為厚度1 mm、尺寸為75 mm×8 mm的薄片，備用。

2.2.2 光子晶體模板的制備采用垂直沉降的膠體自組裝法制備光子晶體模板[31]。首先，將粒徑220～260 nm的SiO2在無水乙醇中超聲分散；然后，加入10 mL離心管中，用無水乙醇稀釋(其中SiO2質(zhì)量濃度為2.5%)；最后，將玻片基質(zhì)以45℃傾斜插入管中，將離心管放到組裝板上，密閉空間下恒溫30℃靜置5～7天左右，待乙醇揮發(fā)完畢后，即制得蛋白石結(jié)構(gòu)的光子晶體模板。

2.2.3 MIPPs的構(gòu)建分別制備BPA和DCD MIPPs的預(yù)聚合溶液。選用BPA與DCD為模板分子，致孔劑為乙醇-水(3∶2，V/V)，功能單體為MAA，交聯(lián)劑為EGDMA，引發(fā)劑為AIBN。

采用后填充技術(shù)[32]構(gòu)建MIPPs。 具體過程如下：首先，將按上述比例配制的預(yù)聚合溶液在毛細(xì)管作用的推動(dòng)下緩慢注入SiO2顆粒組裝的光子晶體模板內(nèi)，然后 PMMA或PET膜覆蓋在光子晶體模板表面，并給予一定壓力，保證膜的成型以及減少聚合溶液蒸發(fā)面積；其次，將覆蓋完成的玻片迅速轉(zhuǎn)移到密閉容器中，通入氮?dú)獬パ鯕?，然后在密閉容器中，用紫外光引發(fā)聚合反應(yīng)3 h；將膜片取出，此時(shí)已制備成功與硅膠光子晶體模板具有互補(bǔ)結(jié)構(gòu)的反蛋白石MIPPs聚合膜；最后，將得到的膜片分子印跡聚合物膜浸入5% (V/V)HF中緩慢攪拌過夜，直至完全刻蝕除去膜上的SiO2微粒，用電鏡觀察。將得到的光子晶體印跡膜用甲醇-乙酸(9∶1，V/V)混合溶液反復(fù)洗脫3次，每次1 h，除去模板分子。作為對(duì)照，非印跡光子晶體聚合物膜(Non-imprinted photonic crystal polymers, NIPPs)除不加入模板分子外，其余操作過程均與分子印跡聚合物膜相同。

2.2.4 制備條件優(yōu)化考察了不同單體使用量對(duì)成膜效果和性能的影響。分別加入不同摩爾比的模板分子與功能單體(1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8，n/n)，混勻后超聲分散10 min，然后加入交聯(lián)劑EGDMA(150 μL)超聲5 min，加入引發(fā)劑((NH4)2SO4， 10 mg)，紫外光引發(fā)聚合反應(yīng)3 h，并考察制備的光子晶體分子印跡膜衍射峰位移的變化。選擇甲醇-乙酸(9∶1，V/V)、甲醇-水-乙酸(7∶2∶1，V/V)、0.1 mol/L乙酸溶液分別作為模板分子的洗脫體系，考察不同洗脫體系對(duì)模板分子的洗脫效果。

2.2.5 吸附性能測(cè)定分別將制備的BPA及DCD MIPPs與NIPPs置于不同濃度的目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)品溶液中，考察其吸附動(dòng)力學(xué)，記錄最大衍射峰位移隨時(shí)間的變化曲線。

配制一系列濃度的DCD與BPA標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將BPA及DCD MIPPs與NIPPs分別置于樣品溶液中孵育，考察吸附行為。采用Specord高精密紫外-可見分光光度計(jì)掃描其最大衍射峰，并計(jì)算在不同濃度目標(biāo)物溶液中MIPPs與NIPPs的最大衍射峰位移量變化值。

2.2.6 環(huán)境水樣分析環(huán)境水樣取自草地邊的河水和湖水，樣品經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾后,在4℃保存，備用。檢測(cè)時(shí)，將制備的MIPPs陣列傳感器分別置入不同樣品中，記錄不同MIPPs傳感單元上的衍射峰位移變化。

3 結(jié)果與討論

3.1 MIPPs的制備

在獲得光子晶體模板之后，將分子印跡預(yù)聚合溶液注入光子晶體模板與PMMA之間的縫隙，直至預(yù)聚合溶液充滿SiO2微球之間的縫隙。功能單體與模板分子(BPA、DCD)通過非共價(jià)作用(氫鍵、范德華力)結(jié)合，然后在交聯(lián)劑作用下，在光子晶體模板上交聯(lián)成反蛋白石結(jié)構(gòu)的網(wǎng)狀聚合物，最后在不同的洗脫體系下洗脫去除模板分子，制備得到對(duì)應(yīng)模板分子的MIPPs。制備的MIPPs可以特異地吸附結(jié)合模板分子，導(dǎo)致聚合物空穴結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，從而產(chǎn)生衍射峰位移，甚至結(jié)構(gòu)顏色的變化。

分別對(duì)單體用量、洗脫條件進(jìn)行了考察。在BPA與DCD用量一定的條件下，當(dāng)單體用量較少時(shí)，構(gòu)成的聚合物膜結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，缺乏剛性；而單體用量越高，制備的聚合物膜結(jié)構(gòu)致密，穩(wěn)定性好，并且制備的MIPPs在置入BPA樣品溶液中衍射峰位移明顯。但是過高的單體用量會(huì)導(dǎo)致構(gòu)成的MIPPs易黏連在基質(zhì)玻片的表面，較脆, 易損壞。綜合考慮，選擇BPA聚合體系中單體用量與模板分子最佳摩爾比為1∶2，DCD聚合體系中單體用量與模板分子的最佳摩爾比為1∶4。此外，不同的體系洗脫，對(duì)MIPPs與模板分子的特異結(jié)合能力有明顯的影響。采用0.1 mol/L乙酸時(shí)，對(duì)DCD的洗脫效果最好；而采用甲醇-水(9∶1，V/V)混合溶液時(shí)，對(duì)BPA的洗脫效果最好。

3.2 形貌表征

采用掃描電子顯微鏡分別對(duì)制備的光子晶體模板和MIPPs的形態(tài)進(jìn)行了分析，結(jié)果如圖1所示。由圖1A可知，制備的光子晶體由SiO2微球周期性有序排列而成，呈蛋白石結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)均一，排列致密有序。由圖1B可見，制備的光子晶體模板由多層SiO2組成，每層微球與微球之間形成有序多孔結(jié)構(gòu)，為分子印跡聚合物的制備提供了充足條件。由圖1C可知，制備的MIPPs具有明顯反蛋白石多孔結(jié)構(gòu)，經(jīng)過刻蝕SiO2微球后的孔穴緊密排列，孔穴直徑約220 nm，分子印跡聚合物構(gòu)成支撐整個(gè)膜的聚合物交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。由于均一多孔的存在，制備的MIPPs具有大的比表面積，并且印跡位點(diǎn)均勻分布在孔穴內(nèi)外，因此對(duì)目標(biāo)物分子的結(jié)合具有傳質(zhì)快、吸附量大、特異性好等特點(diǎn)。

圖1 (A、B)光子晶體模板與(C)反蛋白石結(jié)構(gòu) MIPPs的掃描電子顯微鏡照片F(xiàn)ig.1 Scanning electron microscope images of (A, B) photonic crystal templates and (C) molecular imprinted photonic crystal polymers (MIPPs)

3.3 基于MIPPs膜陣列傳感器的構(gòu)建

將BPA MIPPs(MIPPs@BPA)、BPA非印跡光子晶體聚合物(NIPPs@BPA)、DCD的 MIPPs(MIPPs@DCD)以及DCD非印跡聚合物(NIPPs@DCD)作為傳感單元，組裝到基質(zhì)模板，構(gòu)建陣列傳感器(圖2)。將制備的陣列傳感器置入含有不同濃度的目標(biāo)分析物樣品溶液中，由于傳感單元上的分子印跡作用，傳感單元上的MIPPs可以特異結(jié)合對(duì)應(yīng)的目標(biāo)分析物，引起衍射峰位移。因此，可以通過傳感單元上的MIPPs衍射峰位移量檢測(cè)目標(biāo)物。構(gòu)建的基于MIPPs的傳感器陣列不僅保留了傳統(tǒng)分子印跡聚合物和光子晶體的優(yōu)點(diǎn)，還可以同時(shí)對(duì)BPA和DCD進(jìn)行檢測(cè)，提高了檢測(cè)效率,降低了檢測(cè)成本，為微量目標(biāo)物的快速識(shí)別分析提供了一種新的檢測(cè)方法。

圖2 基于BPA、DCD MIPPs的陣列傳感器制備示意圖：(A)MIPPs@BPA；(B)NIPPs@BPA；(C)MIPPs@DCD；(D)MIPPs@DCDFig.2 Schematic illustration of preparation of a sensor chip based on MIPPs for bisphonel A (BPA) and dicyandiamide (DCD): (A) MIPPs@BPA; (B) NIPPs@BPA; (C) MIPPs@DCD; (D) NIPPs@DCD. PMMA: polymethyl methacrylate

3.4 響應(yīng)時(shí)間

圖3 MIPPs和NIPPs對(duì)BPA和DCD的響應(yīng)時(shí)間Fig.3 Response time of MIPPs and NIPPs for BPA and DCD

對(duì)不同反應(yīng)時(shí)間下MIPPs和NIPPs的衍射峰位移變化進(jìn)行了測(cè)定。由圖3可知，制備的BPA和DCD的MIPPs都在很短的時(shí)間內(nèi)發(fā)生明顯的位移，并且達(dá)到穩(wěn)定，說明構(gòu)建的MIPPs對(duì)目標(biāo)物響應(yīng)迅速。與目標(biāo)溶液分別反應(yīng)2.5和4.0 min后，BPA與DCD的MIPPs衍射峰位移達(dá)到穩(wěn)定。作為對(duì)照的NIPPs也出現(xiàn)位移變化，但是位移量較小。這是由于MIPPs上存在與目標(biāo)物的大小、形狀以及功能基團(tuán)互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，可快速結(jié)合大量的目標(biāo)物分子，從而改變了膜上孔穴的結(jié)構(gòu)，引起明顯的衍射峰位移；而NIPPs主要依靠非特異性吸附結(jié)合目標(biāo)物，因此與目標(biāo)物分子結(jié)合較慢，衍射峰位移不明顯。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，BPA和DCD的MIPPs的響應(yīng)時(shí)間分別為2.5和4.0 min。

3.5 MIPPs對(duì)BPA和DCD的測(cè)定

分別將BPA和DCD的MIPPs置于不同濃度的樣品溶液中，考察衍射峰位移量。由圖4可知，隨著BPA濃度增大，衍射峰逐漸由539 nm移動(dòng)紅移到578 nm，最大位移量為39 nm(圖4A)，同時(shí)，MIPPs@BPA的顏色也發(fā)生變化，由黃綠色逐漸變化為橘紅色。而BPA的NIPPs衍射峰位移變化不明顯(圖4B)，表明BPA的MIPPs具有特異結(jié)合能力，可以通過計(jì)算分析或圖像處理軟件進(jìn)行樣品溶液中BPA的快速定性與定量檢測(cè)。DCD MIPPs膜也具有同樣的現(xiàn)象，隨著樣品中DCD濃度增大，MIPPs@DCD的衍射峰由536 nm逐漸位移到567 nm，最大位移量為31 nm(圖4C)。由圖4可知，NIPPs的衍射峰位移較小，最大位移量小于10 nm，且沒有明顯規(guī)律(圖4B和4D)。由圖4E和4F可知，制備的MIPPs@BPA的衍射峰位移在BPA濃度范圍為0.1～5.0 μg/L時(shí)，與BPA濃度具有良好的線性關(guān)系(R2=0.9964)，檢出限為0.051 μg/L (S/N=3)，低于BPA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)限量值(10 μg/L)[33]； MIPPs@DCD在DCD濃度范圍為0.1～10 μg/L時(shí)具有良好線性關(guān)系(R2=0.9944)，檢出限為0.038 μg/L (S/N=3)。

圖4 (A)MIPPs@BPA、(B) NIPPs@BPA、(C) MIPPs@DCD和(D) NIPPs@DCD在不同濃度對(duì)應(yīng)目標(biāo)物溶液中的衍射峰圖譜(樣品濃度均為0、1、2、4、6、8、10 μg/L，25℃)；(E) MIPPs@BPA衍射峰位移量與BPA濃度的線性關(guān)系；(F)MIPPs@DCD衍射峰位移量與DCD濃度的線性關(guān)系。 Δλ： MIPPs衍射峰位移量Fig.4 Diffraction spectra of (A) MIPPs@BPA, (B) NIPPs@BPA, (C) MIPPs@DCD and (D) NIPPs@DCD in different concentrations (0, 1, 2, 4, 6, 8, 10 μg/L, at 25℃) of corresponding target molecule solutions; (E) Linear relationship between diffraction peak shift of MIPPs and concentration of BPA; (F) Linear relationship between the diffraction peak shift of MIPPs and the concentration of DCD. Δλ: diffraction peak shift

3.6 選擇性

考察了BPA和DCD的MIPPs的選擇性，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，MIPPs @BPA置于BPA樣品溶液中后，其衍射峰位移隨BPA濃度增加而增大；而將MIPPs@BPA置于DCD溶液中時(shí)，其吸附行為和衍射峰位移量與NIPPs@BPA相似，遠(yuǎn)低于其在BPA溶液中的衍射峰位移變化。這說明由于DCD與BPA在結(jié)構(gòu)和功能基團(tuán)上具有明顯差異，制備的MIPPs@BPA不能選擇性捕獲DCD分子，對(duì)DCD分子的結(jié)合能力與非印跡光子晶體聚合物類似，都是通過非特異性結(jié)合，因此衍射峰位移量變化較小。而將MIPPs@DCD置于BPA樣品溶液中，得到了同樣的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備的DCD和BPA MIPPs能夠特異地結(jié)合目標(biāo)物(模板分子)，具有選擇性高、響應(yīng)快等特點(diǎn)。

圖5 制備的MIPPs陣列傳感器分別在不同濃度(0、 1、 2、 4、 6、 8和10 μg/ L，25℃)的(A)BPA和(B)DCD溶液中最大衍射峰位移變化Fig.5 Diffraction peak shift of MIPPs array sensor in different concentrations (0, 1, 2, 4, 6, 8 and 10 μg/L, at 25℃) of (A) BPA and (B) DCD

3.7 實(shí)際樣品分析

采用制備的MIPPs陣列傳感器對(duì)環(huán)境水樣中DCD和BPA進(jìn)行了檢測(cè)。由表1可知，將制備的MIPPs陣列傳感器置入環(huán)境水樣中反應(yīng)4 min后，BPA MIPPs傳感單元的衍射峰發(fā)生了位移，最大位移量分別為(2.0±0.6) nm和(3.0±1.0) nm；而DCD MIPPs傳感單元未能檢出衍射峰變化。在環(huán)境水樣中同時(shí)添加BPA和DCD標(biāo)準(zhǔn)品，采用本方法檢測(cè)，BPA和DCD MIPPs傳感單元的衍射峰位移均顯著增加，最大位移量分別為(27.0±1.7) nm 和 (18.0±1.0) nm。結(jié)果表明，制備的MIPPs陣列傳感器可以有效地檢測(cè)實(shí)際樣品中BPA和DCD，具有操作簡(jiǎn)單、快速、選擇性好和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

表1 制備的MIPPs傳感器對(duì)環(huán)境水樣中BPA和DCD的檢測(cè)

Table 1 Detection of BPA and DCD in environmental water samples by MIPPs array sensors

樣品Sample峰位移量Peak shift (nm, n=3)MIPPs@BPAMIPPs@DCD加標(biāo)量Added(μg/L)加入后衍射峰的位移量Peak shift after addition (nm, n=3)MIPPs@BPAMIPPs@DCD水樣1Water sample 12.0±0.1.0n.d.水樣2Water sample 23.0±1.0n.d.2.014.0±2.011±1.04.023.0±1.016±1.52.016.0±1.513±1.54.027.0±2.018±1.0n.d. 未檢出 Not detectable

4 結(jié) 論

采用分子印跡技術(shù)與光子晶體結(jié)合，構(gòu)建了基于MIPPs的傳感器陣列，并用于樣品中BPA和DCD的快速識(shí)別分析。制備的傳感器對(duì)目標(biāo)物在較低濃度時(shí)就有明顯的衍射峰位移變化，并具有選擇特異性。實(shí)驗(yàn)表明，構(gòu)建的傳感器陣列具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、靈敏度高、響應(yīng)快、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，可以作為一種新方法用于環(huán)境水樣、塑料制品及乳制品中BPA和DCD以及其它小分子物質(zhì)的識(shí)別檢測(cè)。