常天俊 武 俐 卞文秀 邴 濤 趙同謙 上官棣華*

1(河南理工大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院， 焦作 454000)2(中國科學(xué)院化學(xué)研究所， 北京分子科學(xué)國家實驗室， 活體分析化學(xué)院重點實驗室， 北京 100190)

1 引 言

G-四鏈體(G-quadruplex， G4)是由富鳥嘌呤(G)的核酸通過Hoogsteen氫鍵形成的高級結(jié)構(gòu)[1]。G4 DNA具有高度的結(jié)構(gòu)多態(tài)性，包括一條DNA鏈形成的分子內(nèi)平行、反平行或混合平行/反平行G4，兩條或四條DNA鏈(每條鏈不能單獨形成G4)聚集形成的分子間平行或反平行單體G4等多種拓?fù)錁?gòu)型[2]。其中，由一條DNA序列形成的分子內(nèi)平行G4一般較穩(wěn)定，近年來研究發(fā)現(xiàn)，這種序列的多個分子也可聚集在一起形成G4聚集體。Gabelica等[2]的研究表明，具有短Loop的平行G4可形成由四鏈體單體堆積成的多聚體。原癌基因c-kit啟動子區(qū)的一段序列(c-kit2)既可形成分子內(nèi)平行G4，也可同時形成由兩條鏈交叉纏繞的分子間平行G4[3]。在本研究組前期工作中，發(fā)現(xiàn)不同末端序列可導(dǎo)致平行G4組裝成多種分子內(nèi)和分子間結(jié)構(gòu)，“Blunt end”的平行G4 (即3'和5'末端堿基為參與四鏈體形成的G)易形成由四鏈體單體堆積的結(jié)構(gòu)，而兩末端有其它堿基時則可抑制G4單體的堆積，但同時形成了少量新的分子間結(jié)構(gòu)[4]。平行G4的不同聚集形式具有多種功能，如具有抗HIV病毒和抗癌活性的序列d(GGGT)4， 活性結(jié)構(gòu)為單個平行G4堆積的二聚體[5]; 分子內(nèi)平行G4具有普遍的細(xì)胞結(jié)合活性，而分子間平行G4的細(xì)胞結(jié)合能力較差[6]; 分子內(nèi)平行G4結(jié)合Hemin形成的過氧化物酶活性遠(yuǎn)高于分子間平行的G4[7]。 具有廣譜抗癌活性的G4序列AS1411在K+溶液中可形成包括分子內(nèi)平行G4在內(nèi)的8種構(gòu)型， 但目前尚不清楚起關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)成分[8]。平行G4結(jié)構(gòu)的多態(tài)性，尤其是同一序列在溶液中同時形成分子內(nèi)和分子間的結(jié)構(gòu)，影響其結(jié)構(gòu)-活性研究，然而研究者對分子內(nèi)平行G4形成的包括聚集結(jié)構(gòu)在內(nèi)的多態(tài)性關(guān)注較少。探測這些結(jié)構(gòu)成分，發(fā)現(xiàn)起關(guān)鍵作用的結(jié)構(gòu)及形成規(guī)律，將為G4的可控自組裝及生物活性研究提供支持。

目前，已有可直接或間接測定G4構(gòu)型的方法，如核磁共振(Nuclear magnetic resonance spectrum， NMR)[9]或X-射線衍射(X-ray diffraction， XRD)[10]可在原子水平測定G4解析結(jié)構(gòu); 質(zhì)譜(Mass spectrometry)可直接測定G4的分子數(shù)以及與配體的結(jié)合狀態(tài)[11]; 圓二色光譜(Circular dichroism， CD)是分析G4二級結(jié)構(gòu)最常用的技術(shù)之一，在G4結(jié)構(gòu)、離子依賴性以及配體誘導(dǎo)的結(jié)構(gòu)變化等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[12]; 此外，G4折疊和解折疊的紫外-可見吸收光譜不同，通過測定兩個狀態(tài)的差異光譜，可以分析其折疊狀態(tài)及變化[13]; 形成G4的核酸在295 nm處的紫外吸收增加，通過測定該處的光吸收值隨溫度的變化曲線(UV-melting)，可用于分析G4的折疊狀態(tài)及其熱力學(xué)[14]。這些方法能很好地測定溶液中的單一G4結(jié)構(gòu)，但對于溶液中多種構(gòu)型共存則不易分辨具體成分[2,4]。凝膠電泳在檢測從未折疊狀態(tài)到折疊成分子內(nèi)或分子間G4變化等方面廣泛應(yīng)用[15]。為了研究多種結(jié)構(gòu)共存的G4，Kuryavyi等[3]用非變性凝膠電泳分離不同的構(gòu)型，再用NMR解析其在溶液中的結(jié)構(gòu)。然而，這些DNA片段在重新溶解過程中結(jié)構(gòu)可能轉(zhuǎn)化。若能在分離的同時原位分析DNA構(gòu)型，將有助于克服上述問題。特異性結(jié)合G4并產(chǎn)生“熒光打開(Fluorescence ON)”信號的小分子探針近年來得到快速發(fā)展[16～19]，已成為探測G4在體外，甚至活細(xì)胞內(nèi)折疊的重要技術(shù)[20,21]。硫磺素T (Thioflavin T， ThT)是常用于檢測淀粉樣蛋白的苯并噻唑類熒光分子，自Mohanty等[22]發(fā)現(xiàn)其能特異性結(jié)合人端粒G4并產(chǎn)生強熒光信號以來，已在基于G4的生化分析與生物傳感研究中廣泛應(yīng)用[23～28]。ThT除對混合平行/反平行的G4有高親和力外[29]，還能識別RNA G4[30]及i-motif DNA[31]，為在凝膠中對不同G4進行原位染色提供了可能。

c-Myc G4是原癌基因c-Myc啟動子區(qū)的一段富G序列，能形成典型的分子內(nèi)平行G4結(jié)構(gòu)[32]，具有抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖的活性[6]，與Hemin結(jié)合具有高DNAzyme活性[33]。與許多平行G4相似，末端堿基也影響其形成多種分子間結(jié)構(gòu)[4]，這些分子間結(jié)構(gòu)的具體類型、形成規(guī)律以及是否具有生物活性并不清楚。為進一步闡明c-Myc的結(jié)構(gòu)多樣性，本研究以熒光分子ThT作為G4探針，采用熒光光譜、CD光譜等方法比較ThT與典型分子內(nèi)和分子間G4，以及含不同A/T末端堿基的c-Myc的相互作用; 在此基礎(chǔ)上，用ThT對非變性凝膠電泳分離的G4直接染色，再用全染色劑Stains-all對所有DNA條帶進行顯色，比較同一DNA條帶經(jīng)兩種染色的光密度值，分析判斷DNA條帶的拓?fù)錁?gòu)型，并探討末端堿基對c-Myc G4自組裝結(jié)構(gòu)的影響。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

UV-2550紫外-可見分光光度計、S-1700精密控溫裝置(日本Shimadzu公司); F-7000熒光儀(日本Hitachi公司); J-815圓二色光譜儀(日本JASCO公司); DYCZ-24DN型雙垂直電泳儀(北京六一公司); AlphaImagerTM凝膠成像系統(tǒng)(美國Alpha Innotech公司)。

DNA由生工生物(上海)有限公司合成與純化(序列見表1); ThT (分析純，北京百靈威化學(xué)科技有限公司); Stains-all(純度97%，美國ACROS 公司)，ThT與Stains-all的分子式見圖1; 其它試劑均為分析純，購自國藥(上海)化學(xué)試劑公司。實驗用水為超純水 (18.2 MΩ cm，美國Millipore超純水系統(tǒng)制備)。

表1 所用寡核苷酸序列

Table 1 Oligonucleotides used in this study

名稱Name序列Sequence (5' to 3')c-Myc2345TGAG3TG4AG3TG4A2c-MycAAG3TG4AG3TG3Ac-MycTTG3TG4AG3TG3Tc-Myc2AA2G3TG4AG3TG3A2c-Myc2TT2G3TG4AG3TG3T2名稱Name序列Sequence (5' to 3')c-Myc3AA3G3TG4AG3TG3A3c-Myc3TT3G3TG4AG3TG3T3G6T4G6T4G8T4G8T4G4T3G4G4T3G4名稱Name序列Sequence (5' to 3')M15(AAGT)3AAGM20(AAGT)5M30(AAGT)7AAM40(AAGT)10

圖1 ThT和Stains-all分子式以及分子內(nèi)與分子間平行、提籃式分子間反平行G4結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic of thioflavin T (ThT), Stains-all, intramolecular parallel G-quadruplex (G4), intermolecular parallel G4 and intermolecular antiparallel G4

2.2 DNA樣品溶液制備

DNA溶解于Tris-HCl緩沖液 (25 mmol/L， pH=7.6) 中。用紫外-可見分光光度計測定DNA樣品在260 nm的吸光度值，根據(jù)相應(yīng)序列的摩爾吸光系數(shù)計算得到DNA的濃度。為了形成穩(wěn)定的G4結(jié)構(gòu)，在適當(dāng)濃度的DNA溶液中加入終濃度為20 mmol/L的 KCl或NaCl，95℃變性10 min，緩慢冷卻至室溫，備用。

2.3 熒光光譜的測量

將DNA樣品(1 μmol/L)與ThT在室溫孵育5 min后，測量溶液的熒光光譜或熒光強度。 熒光光譜測量采用400 μL、1 cm光程的石英四通比色皿，激發(fā)波長為425 nm，掃描并收集發(fā)射波長在440～650 nm范圍的熒光光譜或490 nm的熒光強度數(shù)據(jù)。所得數(shù)據(jù)為3次重復(fù)測量的平均值。

2.4 CD光譜測量

5 μmol/L DNA樣品(含20 mmol/L KCl或NaCl)經(jīng)變性/復(fù)性處理后，于25℃測試CD光譜。在1 cm光程的石英比色皿中，加入400 μL樣品，以200 nm/s的速度掃描3次，收集220～320 nm的CD信號。為了測量ThT對DNA構(gòu)型的影響，不同濃度的ThT與DNA樣品在室溫孵育5 min后測定CD光譜。 CD光譜數(shù)據(jù)為掃描3次的平均值，經(jīng)OriginPro 8.0軟件平滑處理，并預(yù)先扣除緩沖液背景吸收。

2.5 凝膠電泳與染色分析

采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)分析DNA(20 μmol/L，含20 mmol/L KCl或NaCl)，使用7 cm × 10 cm的20%聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺-甲叉雙丙烯酰胺，19∶1，m/m)。 4℃下以9 V/cm電泳4～5 h。電泳緩沖液為1×TBE (89 mmol/L Tris，2 mmol/L EDTA，89 mmol/L硼酸，pH=8.3)。為了維持G4結(jié)構(gòu)，凝膠和電泳緩沖液中分別加入20 mmol/L的相應(yīng)離子。

在室溫下， 用ThT (6 μmol/L)對凝膠染色15 min，在紫外光照射下， 與G4 DNA結(jié)合的ThT分子熒光被激發(fā)，通過凝膠成像系統(tǒng)觀測被染色的G4 DNA。將上述凝膠用超純水洗滌后，再用全染色劑Stains-all進行染色; 在日光光照下，未與DNA結(jié)合的染料分子褪成無色，結(jié)合在DNA上的分子仍為藍(lán)色[34]，利用凝膠成像儀記錄所有DNA條帶被染色的圖像。ThT或Stains-all染色條帶的光密度值(OD)用ImageJ 軟件(ImageJ 1.48V, Wayne Rasband, National Institutes of Health, 美國)進行定量分析。

3 結(jié)果與討論

3.1 熒光法分析ThT與c-Myc序列的相互作用

圖2 不同DNA序列存在下的ThT的熒光強度Fig.2 Fluorescence intensity of ThT in the presence of various DNAsλex=425 nm; λem=490 nm

為了實現(xiàn)在分離的同時可視化探測G4多種構(gòu)型，進而研究末端堿基在G4自組裝中的作用，首先考察了溶液狀態(tài)下ThT對含不同末端堿基的c-Myc G4的識別?？紤]到在G4末端增加C或G堿基可能導(dǎo)致形成雙鏈或更復(fù)雜的G4類型，本研究僅在c-Myc G4的核心序列d(G3TG4AG3TG3)末端加上不同數(shù)目的A或T(序列見表1)。為了分析多種可能的結(jié)構(gòu)形式，選擇以下序列為對照: 可形成分子內(nèi)平行G4的序列c-Myc2345[1]，可形成四分子間平行G4的序列G6、G8[7]，可形成提籃式雙分子間反平行G4的序列G4T3G4[1](G4不同結(jié)構(gòu)示意圖見圖1); 非G4的對照單鏈序列M20和雙鏈dsM20(序列見表1，dsM20為M20與互補鏈配對所形成)。首先測試了在K+或Na+溶液中不同DNA激活ThT熒光的效果(圖2)。 ThT在水溶液中熒光很弱，非G4單鏈和雙鏈增強ThT的熒光約為背景值2倍; 在K+溶液中，含有不同末端堿基的c-Myc衍生序列(c-MycA、c-MycT、c-Myc2A、c-Myc2T、c-Myc3A和c-Myc3T)能使ThT熒光增強100～200倍，其中末端A或T堿基數(shù)增加有利于熒光增強，且T堿基的增強效果略大于A堿基。與K+相比，在Na+溶液中c-Myc2345對ThT的熒光增強效果更高，與文獻[29]報道一致; 但其它衍生序列的熒光增強效應(yīng)都減弱， c-Myc2A和c-Myc3A對ThT熒光增強的效果高于其它序列。此外，可形成分子間結(jié)構(gòu)的G6和G8在K+中對ThT熒光增強高達(dá)200倍以上，但在Na+溶液中，其增強效果發(fā)生了顯著降低; 雙分子間反平行G4(G4T3G4)在兩種離子中激活ThT熒光的能力都很差，僅略高于非G4的單鏈或雙鏈序列。

3.2 CD光譜表征c-Myc序列的結(jié)構(gòu)

圖3 DNA在與ThT作用前后的CD光譜及CD光譜變化，DNA與ThT濃度均為5 μmol/LFig.3 Circular dichroism (CD) spectra of 5 μmol/L DNAs in the absence or presence of 5 μmol/L ThT

CD光譜可表征典型G4二級結(jié)構(gòu)及構(gòu)象變化，反平行G4在295 nm 處顯示正峰，在260 nm 處為負(fù)峰; 平行G4在260 nm 附近顯示正峰，在240 nm 處顯示負(fù)峰[1]。為了進一步研究ThT的熒光增強與G4的關(guān)系，本研究測量了G4 DNA的CD光譜及其與相同濃度的ThT作用后的CD光譜變化(圖3)。K+溶液中，所有序列的CD光譜在260 nm為正峰，240 nm為負(fù)峰，表明此條件下形成平行G4; 加入ThT后各序列CD光譜變化很小(圖3)，表明與ThT作用后并未影響這些序列已形成的結(jié)構(gòu)。Na+溶液中，CD光譜顯示，含不同末端堿基的c-Myc序列形成了多種結(jié)構(gòu): c-MycA的CD正峰在280 nm附近，負(fù)峰在250 nm處，主要為非G4結(jié)構(gòu); c-Myc2A與c-Myc3A在260 nm處為正峰，240 nm附近為負(fù)峰，主要為平行G4結(jié)構(gòu); c-MycT、c-Myc2T與c-Myc3T除了295 nm正的肩峰外，還在255～280 nm有寬的正峰，提示為非G4、平行和反平行G4等多種結(jié)構(gòu)共存。加入同樣濃度的ThT后，c-Myc2A、c-Myc3A、c-MycT、c-Myc2T、c-Myc3T及c-Myc2345在Na+溶液中260 nm附近的吸收增加并形成正峰，而且c-MycT、c-Myc2T和c-Myc3T在290 nm的肩峰降低，說明ThT能促進這些序列形成平行G4; c-MycA的CD光譜變化不大。另外，CD光譜顯示，G6在K+溶液中存在260 nm的正峰，表明能形成平行的分子間G4，但Na+溶液中260 nm的正峰消失，表明未形成G4; G8在兩種離子條件下都存在平行G4的特征CD信號，且在K+中信號更強，表明在K+中形成G4的能力更強; 加入ThT對兩個序列的CD光譜影響較小。

3.3 組合染色分析c-Myc G4多態(tài)性及末端堿基對其自組裝的影響

上述結(jié)果已表明，末端序列對c-Myc與ThT的識別有較大影響，與文獻[35]報道現(xiàn)象類似; 此外，分子間與分子內(nèi)平行的G4結(jié)構(gòu)均可增強ThT的熒光，但分子間平行結(jié)構(gòu)更強。本研究組的前期工作中，發(fā)現(xiàn)含有不同末端堿基的c-Myc除了能形成分子內(nèi)平行G4外，還能形成部分分子間聚集結(jié)構(gòu)[4]。因此，需考察末端序列不同的c-Myc與ThT的不同識別能力是由末端序列與ThT的作用引起，還是末端序列引起c-Myc形成了不同的分子間聚集結(jié)構(gòu)所引起。由于CD光譜不能分辨同一個序列在溶液中存在的多種結(jié)構(gòu)，例如由同一個序列形成的分子間與分子內(nèi)平行結(jié)構(gòu)，為了進一步探討不同末端堿基是否導(dǎo)致c-Myc序列產(chǎn)生不同拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，進而引起不同的ThT熒光增強效果，本研究在凝膠中分離上述序列所形成的結(jié)構(gòu)，并用ThT直接染色凝膠中的DNA條帶。

圖4 組合染色分析DNA在K+或Na+溶液中的多態(tài)性結(jié)構(gòu)(A) ThT和Stains-all對同一凝膠分別染色的圖像; (B)同一電泳條帶分別經(jīng)ThT與Stains-all染色的灰度比值，DNA分子量Marker為40、30、20和15堿基長的單鏈非G4 DNAFig.4 Double-staining of DNA structures by ThT and Stains-all in 20 mmol/L KCl (left) or NaCl (right)(A) Images of gels stained in turn by ThT and Stains-all. (B) TheOD ratio of the DNA bands stained by ThT and SA. Molecular weight (MW) ladder was ssDNA mixtures with 40, 30, 20 and 15 bases, respectively. “c-Myc2345”, “c-MycA”, “c-MycT”, “c-Myc2A”, “c-Myc2T”, “c-Myc3A” and “c-Myc3T” are abbreviated to “2345”, “A”, “T”, “2A”, “2T”, “3A” and “3T”(已替換)

為了觀測所有DNA片段，用非特異性染色劑Stains-all對ThT染色后的凝膠進行顯色(圖4)。Stains-all染色可清楚顯示出不被ThT染色的分子量Marker(MW，序列見表1，分別用M40、M30、M20和M15命名)，根據(jù)其片段大小將遷移速率不同的條帶進行分區(qū): 發(fā)現(xiàn)c-Myc系列衍生序列在K+溶液中以分子內(nèi)結(jié)構(gòu)為主，但都能形成部分分子間結(jié)構(gòu)(> 40 bases); 而在Na+溶液中，c-Myc2A和c-Myc3A形成了另一種分子間結(jié)構(gòu)(～ 30 bases)，其它衍生序列主要是分子內(nèi)結(jié)構(gòu)(圖4A)。從ThT染色結(jié)果可知，以上序列形成的分子間或分子內(nèi)結(jié)構(gòu)都能被熒光特異性染色，而在Na+溶液中，G6和 G8中的單鏈成分(凝膠中第3區(qū)域的片段，分子量在15～25堿基之間)都不能被熒光染色。Stains-all是一種陽離子羰花青染料，可通過靜電作用與所有DNA非特異性結(jié)合，以末端堆積結(jié)合G4的ThT不干擾Stains-all對DNA的進一步染色，因此可用Stains-all染色的DNA條帶光密度值評估該條帶的含量?？紤]到 G4 DNA對ThT的熒光增強除了與其結(jié)構(gòu)特征有關(guān)，也與G4的含量有關(guān)，為了比較G4的不同結(jié)構(gòu)類型與ThT的結(jié)合差別，以Stains-all染色條帶的光密度值表示DNA的含量，以該條帶分別經(jīng)ThT與Stains-all染色的光密度比值對熒光增強進行歸一化處理。從圖4B可見，所有分子間平行G4結(jié)構(gòu)(包括G6和G8在K+中)或分子間聚集體的光密度比值都大于1，分子內(nèi)平行G4結(jié)構(gòu)類型的光密度比值約0.5，不能被ThT染色的非G4條帶光密度比值為0。這些數(shù)據(jù)表明，單位濃度G4的分子間結(jié)構(gòu)對ThT熒光的增強能力最強，分子內(nèi)結(jié)構(gòu)次之，非G4不能增強ThT的熒光。由于18堿基的c-MycA在Na+溶液中不能形成G4(圖3)，但其在凝膠中的片段所在位置小于15個堿基，也小于同為18個堿基的c-MycT(圖4A); 其光密度比值較低(～ 0.2)(圖4B)，介于非G4的單鏈序列(Marker)與分子內(nèi)G4之間。進一步測試了不同濃度的ThT在Na+溶液中與c-MycA作用的CD光譜，結(jié)果表明，高濃度ThT可誘導(dǎo)其形成G4，而非G4的單鏈?zhǔn)苡绊懞苄?圖5)，提示ThT誘導(dǎo)c-MycA形成了部分G4，進而引發(fā)自身熒光，使得凝膠中其光密度比值介于非G4和分子內(nèi)G4之間。

圖5 Na+溶液中c-MycA及對照單鏈DNA(M20)與不同濃度比例的ThT作用的CD光譜及變化 Fig.5 CD spectra of 5 μmol/L c-MycA or ssDNA (M20) in the presence of various concentrations of ThT in Na+ solution

以上結(jié)果表明，在K+溶液中， 末端堿基數(shù)增加對ThT熒光的影響也增強，末端堿基數(shù)相同的序列中T堿基表現(xiàn)出更強的熒光增強能力(圖2); 在Na+溶液中，末端為2個以上A的c-Myc2A和c-Myc3A對ThT熒光增加影響更大(圖2); 這些對ThT熒光增強影響大的序列具有相對較多的分子間結(jié)構(gòu)成分(圖4)，且都能形成平行G4(圖3)。上述結(jié)果提示末端堿基引起c-Myc形成不同的分子間G4聚集體可能是其結(jié)合ThT產(chǎn)生不同熒光增強的主要原因，而且這種影響存在離子和序列選擇性，即在K+溶液中，增加末端堿基的數(shù)目有利于形成分子間聚集體，其中T堿基的作用更強; 而在Na+溶液中，兩個或以上的A堿基可引起c-Myc形成分子數(shù)較小的分子間結(jié)構(gòu)，T堿基則不能。這表明在涉及末端堿基影響的G4分子識別研究中，若缺少對DNA構(gòu)型多態(tài)性的分析，這種差異可能會被認(rèn)為僅由末端堿基與配體的相互作用所致。

本研究中，熒光光譜(圖2)與凝膠電泳分析(圖4)結(jié)果均顯示ThT對分子間平行G4或分子間平行G4聚集體具有高選擇性，已有的研究也指出ThT對反平行或混合平行/反平行G4的選擇性優(yōu)于分子內(nèi)平行G4結(jié)構(gòu)[22,29]。近期研究發(fā)現(xiàn)，RNA aptamer“Corn”形成的二聚體可強烈激活ThT的熒光，與僅有一個G4結(jié)構(gòu)的Aptamer“Spinach”比較，ThT與“Corn”二聚體結(jié)合位點兩側(cè)的G4能更好束縛光激熒光團，使G4二聚體具有更強的ThT熒光激活能力[36]。本研究組之前的研究發(fā)現(xiàn)，反平行G4或未折疊成G4結(jié)構(gòu)的G4形成序列與小分子BMSP(2,9-bis[4-(4-methylpi-perazin-1-yl)styryl]-1,10-phenanthroline)的結(jié)合可強烈激活其熒光，且遠(yuǎn)高于穩(wěn)定的分子內(nèi)平行G4結(jié)合BMSP產(chǎn)生的熒光[37]。通常， 同等構(gòu)型下分子間G4的穩(wěn)定性弱于分子內(nèi)G4結(jié)構(gòu)，反平行或混合平行/反平行G4結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性弱于分子內(nèi)平行結(jié)構(gòu)。上述研究結(jié)果說明，G4最穩(wěn)定的構(gòu)像不一定是最佳的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)。

相對于分子內(nèi)平行G4結(jié)構(gòu)，平行G4結(jié)構(gòu)形成的分子間聚集體受關(guān)注較少，也缺乏簡單有效的研究方法。本研究初步建立了原位多重染色與G4探針、CD光譜結(jié)合的方法，并用圖像分析工具進行分析，可實現(xiàn)多種構(gòu)型的同時分離與分析，并能用于G4自組裝規(guī)律的研究。然而，本研究在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上對分子間G4聚集進行分析，雖可區(qū)分分子間與分子內(nèi)結(jié)構(gòu)，但不能準(zhǔn)確測定聚集的分子數(shù)以及聚集狀態(tài)。此外，ThT雖然可結(jié)合不同G4產(chǎn)生強的熒光，但ThT對一些非G4結(jié)構(gòu)的識別[38]可能限制其進一步應(yīng)用; 開發(fā)特異識別不同G4聚集體的新型熒光探針[39,40]，將有助于系統(tǒng)深入探討G4自組裝的規(guī)律。

4 結(jié) 論

平行G4結(jié)構(gòu)是很多核酸藥物以及核酸適配體的活性結(jié)構(gòu)，然而， 平行G4結(jié)構(gòu)受溶液條件和序列等因素的影響可形成不同形式的分子間聚集體，不利于其結(jié)構(gòu)與功能研究。本工作研究了具有重要生物活性且能形成平行G4結(jié)構(gòu)的c-Myc序列，以ThT為熒光探針，結(jié)合DNA非選擇性染料Stains-all和光密度定量分析工具，在凝膠中直接分析了其結(jié)構(gòu)多態(tài)性及末端堿基對自組裝的影響。本研究策略可較好地實現(xiàn)c-Myc G4多種構(gòu)型的同時分離與探測，有助于理解多種構(gòu)型共存的G4自組裝及其構(gòu)效關(guān)系。本研究表明，ThT除對多種平行G4有一定識別能力外，對分子間和分子內(nèi)平行G4之間也有一定的選擇性，在G4多態(tài)性結(jié)構(gòu)的分析中有良好的應(yīng)用前景。此外，本方法采用對DNA具有不同識別能力的商業(yè)化染料組合，通過凝膠電泳直接染色分析G4結(jié)構(gòu)多態(tài)性，價格低廉，操作簡便，實用性強。