(深圳市第三人民醫(yī)院骨科,廣東 深圳 518000)

骨肉瘤是兒童及青少年最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，最常見于股骨遠(yuǎn)端、脛骨近端或肱骨，15%～20%的患者在診斷時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移，特別是在肺和骨骼，且發(fā)展迅速[1]。典型的臨床癥狀主要是受累骨骼的疼痛和腫脹。目前的治療策略為術(shù)前化療，然后手術(shù)切除原發(fā)腫瘤以及可檢測(cè)的轉(zhuǎn)移性腫瘤，再輔以術(shù)后化療[2]。聯(lián)合運(yùn)用甲氨蝶呤、多柔比星和順鉑的多藥物化療方案可以改善患者的預(yù)后，未發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者5年生存率為65%～70%，已發(fā)生轉(zhuǎn)移的患者5年生存率為19%～30%[3]。盡管隨著手術(shù)方式的改進(jìn)和化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用，骨肉瘤患者的5年生存率獲得了明顯的提高，但進(jìn)一步改善預(yù)后遇到了瓶頸，因此急需開發(fā)新的藥物改善患者預(yù)后，進(jìn)一步提高患者生存質(zhì)量[4]。

磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)是脂質(zhì)激酶，充當(dāng)中間信號(hào)分子，將來自細(xì)胞外刺激的信號(hào)轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)。這些途徑調(diào)節(jié)許多必需的細(xì)胞過程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖、運(yùn)動(dòng)和新陳代謝等[5]。PI3K信號(hào)通路是癌癥中最常見的失調(diào)途徑之一，其在調(diào)節(jié)作為癌癥特征的細(xì)胞過程(如細(xì)胞增殖、凋亡或遷移)中起主要作用。此外，在人類癌癥中也經(jīng)常觀察到這些酶的激活突變，導(dǎo)致癌癥生長(zhǎng)。因此P13K途徑已經(jīng)成為抗癌藥物開發(fā)的主要焦點(diǎn)[6]。TGX-221是一種高效的、選擇性的PI3K p110β抑制劑，目前已經(jīng)在包括膠質(zhì)瘤、前列腺癌、腎透明細(xì)胞癌等腫瘤細(xì)胞中發(fā)揮抗腫瘤作用，但能否在骨肉瘤中發(fā)揮抗腫瘤作用依舊未知。本研究通過體外培養(yǎng)骨肉瘤U2OS和MG-63細(xì)胞，給予TGX-221干預(yù)，觀察其作用及影響，初步探究TGX-221對(duì)骨肉瘤的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TGX-221購(gòu)自美國(guó)MCE公司，根據(jù)說明書用DMSO配置成5 μmol/L的工作液,置于-80 ℃長(zhǎng)期保存；U2OS和MG-63細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gbico公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、PBS、胰蛋白酶、青/鏈霉素購(gòu)自上海吉諾生物科技有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自碧云天生物有限公司；凋亡試劑盒PE/7AAD購(gòu)自美國(guó)BD公司；CCK8購(gòu)自日本同仁公司；PI購(gòu)自安特捷公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人骨肉瘤細(xì)胞U2OS和MG-63細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基放置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞長(zhǎng)至融合度達(dá)90%后用胰酶?jìng)鞔瑢?shí)驗(yàn)選用處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞。

1.2.2 CCK8法檢測(cè)TGX-221濃度梯度對(duì)細(xì)胞活力的影響 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化，1 000 r/min離心5 min后，用完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%青/鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基)輕輕沖懸，計(jì)數(shù)。將人U2OS和MG-63細(xì)胞種植入96孔板里，每個(gè)濃度梯度設(shè)置3組復(fù)孔，每孔加入200 μL的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。第2天分別加入0、2.5、5、10、15、20、25 μmol/L的TGX-221，37 ℃培養(yǎng)48 h后棄培養(yǎng)基。重新加入100 μL含10 μL CCK8的完全培養(yǎng)基，37 ℃避光孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(OD)值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 CCK8法檢測(cè)TGX-221作用時(shí)間對(duì)細(xì)胞活力的影響 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化，離心，計(jì)數(shù)后按照6×103/孔的密度將細(xì)胞種植到96孔板里，設(shè)置4個(gè)時(shí)間梯度(0 h、24 h、48 h、72 h)。分別在0 h、24 h、48 h、72 h測(cè)量對(duì)應(yīng)梯度的OD值，繪制活性曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U2OS和MG-63細(xì)胞用胰酶消化，離心后沖懸。設(shè)置實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，把相同數(shù)目的細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)24 h，然后棄培養(yǎng)基，用PBS清洗2遍后加入不含血清的高糖培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。24 h后棄培養(yǎng)基，重新加入完全培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組加入10 μmol/L的TGX-221，對(duì)照組則加入相同劑量的DMSO。孵育24 h后用胰酶消化，離心，PBS清洗后再次離心，然后加入-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇4 mL，震蕩沖懸后放置于-20 ℃固定過夜。第2天離心，用PBS清洗2遍后加入500 μL的PBS和10 μL的RNA酶，置于37 ℃水浴鍋溫浴30 min。然后加入10 μL的碘化丙啶(PI)，避光孵育20 min后上機(jī)測(cè)試。用ModFit LT 4.1軟件分析細(xì)胞周期。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞種植到6孔板里，待細(xì)胞長(zhǎng)到融合度為60%的時(shí)候在實(shí)驗(yàn)組里面加入TGX-221，使得培養(yǎng)濃度為10 μmol/L。對(duì)照組里則加入相同劑量的DMSO，放置于37 ℃的培養(yǎng)箱孵育24 h。收集培養(yǎng)基，用不含EDTA的胰酶消化，離心并用PBS清洗殘留的培養(yǎng)基。然后加入1 mL稀釋為1×的Binding Buffer，沖懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移到流式管里。每管細(xì)胞各加入5 μL的PE和7-AAD，避光室溫孵育10 min后上機(jī)測(cè)試。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 TGX-221可以有效抑制U2OS和MG-63細(xì)胞的增殖

結(jié)果顯示，隨著TGX-221作用濃度的增加，450 nm波長(zhǎng)處的OD值逐漸減??；隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組之間的OD值差距愈發(fā)變大，對(duì)照組顯示出更強(qiáng)的增殖能力，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

a、b：TGX-221以劑量依賴性的抑制U2OS和MG-63細(xì)胞的增殖；c、d：TGX-221呈時(shí)間依賴性抑制U2OS和MG-63細(xì)胞的增殖

* ：與實(shí)驗(yàn)組比較，P<0.05； #：與實(shí)驗(yàn)組比較，P<0.01

圖1 TGX-221對(duì)人骨肉瘤U2OS和MG-63細(xì)胞增殖的影響

2.2 TGX-221阻滯U2OS和MG-63細(xì)胞的細(xì)胞周期于G1期

結(jié)果顯示，在人骨肉瘤U2OS和MG-63細(xì)胞系中，實(shí)驗(yàn)組中處于G1期的的細(xì)胞比例高于對(duì)照組，差異有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組中處于G2期和S期的細(xì)胞比例也有不同程度的下降，表明TGX-221可以阻滯人骨肉瘤細(xì)胞的周期進(jìn)展(圖2)。

2.3 TGX-221誘導(dǎo)U2OS和MG-63細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組加入TGX-221處理24 h后的細(xì)胞凋亡比例增加，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明TGX-221能夠通過誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用(圖3)。

a、b：TGX-221將人骨肉瘤U2OS細(xì)胞阻滯于G1期;c、d：TGX-221將人骨肉瘤MG-63細(xì)胞阻滯于G1期 #：與對(duì)照組比較，P<0.01

a、b：TGX-221誘導(dǎo)人骨肉瘤U2OS細(xì)胞凋亡; c、d：TGX-221誘導(dǎo)人骨肉瘤MG-63細(xì)胞凋亡 *：與對(duì)照組比較，P<0.05

3 討論

骨肉瘤是世界上最常見的原發(fā)性骨惡性腫瘤，起源于骨骼系統(tǒng)的結(jié)締組織，尤其好發(fā)于多發(fā)性骨髓瘤患者[7]。骨肉瘤大約占所有癌癥的6%和兒童及青少年惡性骨癌病例的56%。目前通常采取多種方式聯(lián)合治療，包括最大限度的手術(shù)切除、輔助化療與保肢重建手術(shù)。由于化療的引入和腫瘤的手術(shù)切除，局部骨肉瘤患者的5年生存率有了顯著提高[8-11]。然而，常規(guī)化療也存在不少缺點(diǎn)，例如化療藥物往往對(duì)正常組織具有高毒性，易導(dǎo)致貧血、中性粒細(xì)胞減少、血小板減少、心臟損傷等一系列不良反應(yīng)[12]。此外，骨肉瘤化療還需面臨的一大障礙是化療藥物的交叉性耐藥，多藥耐藥基因MDR1編碼的P-糖蛋白(P-gp)通過將細(xì)胞內(nèi)藥物逆濃度梯度運(yùn)出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度不斷下降而達(dá)不到有效殺傷濃度，從而產(chǎn)生耐藥性。因此，新藥物的開發(fā)具有十分重要的意義[13]。

PI3K的雷帕霉素/AKT/哺乳動(dòng)物靶蛋白(mTOR)途徑在包括骨肉瘤在內(nèi)的許多腫瘤中被過度激活，是腫瘤進(jìn)展和化療抗性的一個(gè)重要因素。PI3K是由p85和p110催化亞基組成的異二聚體，是受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase，RTK)下游的主要信號(hào)傳導(dǎo)組分，PI3K激活其下游Akt，其磷酸化影響下游多種底物，涉及多種細(xì)胞過程，包括細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡和代謝，這些過程對(duì)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展至關(guān)重要。目前已開發(fā)出許多靶向該途徑的藥物，TGX-221就是其中之一，是一種高效的PI3K p110β抑制劑[14-16]。Yang等[17]研究證實(shí)，TGX-221可以抑制人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Chen等[18]研究發(fā)現(xiàn),TGX-221可以阻斷裸鼠中前列腺癌的異種移植腫瘤生長(zhǎng)。這些研究表明，TGX-221可能是一種潛在的抗腫瘤藥物，但目前在骨肉瘤中能否發(fā)揮抗腫瘤作用和可能的抗腫瘤機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探究TGX-221對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS和MG-63細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期和凋亡的影響，為未來可能進(jìn)行的臨床試驗(yàn)提供理論依據(jù)。

惡性腫瘤最主要的特征就是無限增殖、永生化，因此抑制腫瘤細(xì)胞的惡性增殖是藥物研發(fā)的關(guān)鍵。本研究設(shè)置了0、2.5、5、10、15、20、25 μmol/L共7個(gè)濃度，探究骨肉瘤細(xì)胞隨著TGX-221作用濃度增加的活性變化。結(jié)果顯示，隨著作用濃度的增加，測(cè)量出的OD值逐漸降低，表明TGX-221可以劑量依賴性地抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖。同時(shí)，本研究設(shè)置了時(shí)間梯度，選擇10 μmol/L作為實(shí)驗(yàn)濃度，分別測(cè)量骨肉瘤細(xì)胞在 0 h、24 h、48 h、72 h的OD值。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的OD值增加緩慢，且與對(duì)照組之間的OD值差距愈發(fā)增大，表明TGX-221可以有效地抑制人骨肉瘤U2OS和MG-63細(xì)胞的增殖。

細(xì)胞周期分為G1期、S期、G2期和M期。G1期是DNA復(fù)制前期，主要是為DNA的復(fù)制做準(zhǔn)備；S期又稱DNA合成期；G2期主要為有絲分裂做準(zhǔn)備；M期即有絲分裂期。G1期被認(rèn)為是啟動(dòng)細(xì)胞周期的關(guān)鍵時(shí)期，惡性腫瘤發(fā)生的一個(gè)核心事件是正常的細(xì)胞周期失去調(diào)控，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞可以無限增殖。本研究探究了TGX-221對(duì)U2OS和MG-63細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組處于G1期的細(xì)胞比例增加，表明TGX-221可阻滯細(xì)胞周期于G1期，這些細(xì)胞逐漸失去增殖能力，不再分裂，日趨衰老。這類細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生高度分化，對(duì)腫瘤增殖沒有作用，因此G1期細(xì)胞所占數(shù)量越多，腫瘤的惡性程度越低[19]。

腫瘤的生長(zhǎng)取決于增殖與凋亡之間細(xì)胞的平衡狀態(tài)，化療藥物就是通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[20]。我們?cè)谘芯壳捌谧C實(shí)了TGX-221在體外抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。因此，我們進(jìn)一步探究了TGX-221對(duì)骨肉瘤細(xì)胞凋亡的作用，結(jié)果表明，TGX-221可在體外促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。

綜上，本研究在骨肉瘤細(xì)胞中證實(shí)，TGX-221可以抑制U2OS和MG-63細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期于G1期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此我們推測(cè)，TGX-221通過將大量的骨肉瘤細(xì)胞阻滯于G1期，抑制骨肉瘤細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換，使得骨肉瘤細(xì)胞失去了增殖能力，引起細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。