(1.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科,重慶 400038；2.陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院全科醫(yī)學(xué)系,重慶 400038)

在急救和危重患者搶救中，機(jī)械性通氣技術(shù)的臨床應(yīng)用尤為重要，而呼吸機(jī)所致肺損傷(ventilator-induced lung injury，VILI)則是危重患者進(jìn)行機(jī)械通氣支持治療時(shí)常見的嚴(yán)重并發(fā)癥，在呼吸機(jī)廣泛使用的今天，重癥患者VILI發(fā)生率可高達(dá)21%[1]。研究表明，患者接受治療前使用呼吸機(jī)進(jìn)行大潮氣量通氣會(huì)導(dǎo)致肺部不同程度的損傷[2-3]。臨床上主要以CO2吸入、抗炎治療及腎上腺素受體藥物治療、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)藥物治療為主，但目前尚無(wú)一種藥物可特異性改善VILI的預(yù)后。因此，研究VILI的發(fā)病機(jī)制和防治措施對(duì)患者預(yù)后及改善呼吸機(jī)的使用效果具有重要意義。VILI以往被認(rèn)為是由于頻率過(guò)快、通氣量過(guò)高等不恰當(dāng)?shù)脑O(shè)置引起肺內(nèi)或氣道內(nèi)容量或壓力過(guò)大而導(dǎo)致的損傷[4]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，VILI發(fā)病過(guò)程中涉及大量炎癥因子的活化和釋放，說(shuō)明炎癥反應(yīng)在VILI的發(fā)生與發(fā)展中起重要作用[5-6]。

丙泊酚為一種烷基酸類短效靜脈鎮(zhèn)靜劑，目前被用于麻醉的維持和誘導(dǎo)，特別適用于外科小手術(shù)、門診活體檢查以及危重監(jiān)護(hù)病房患者的鎮(zhèn)靜[7-8]。通常情況下，在使用丙泊酚1 min內(nèi)即可進(jìn)入睡眠狀態(tài)，丙泊酚可由肝代謝，代謝物隨尿液排出。研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚對(duì)嘔吐、免疫反應(yīng)、焦慮、疼痛均有一定的改善作用，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)也具有一定保護(hù)作用，其作用已經(jīng)在多種體內(nèi)模型得到了驗(yàn)證[9-10]。但關(guān)于丙泊酚對(duì)VILI的保護(hù)作用的機(jī)制研究卻少有報(bào)道。因此，本研究擬利用大潮氣量通氣法制備VILI大鼠模型，以探究丙泊酚對(duì)其保護(hù)作用和潛在的調(diào)控機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)資料

SD大鼠30只，雄性，體質(zhì)量(220±20)g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0020。將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、丙泊酚組，每組10只。

丙泊酚注射液購(gòu)自西安力邦制藥有限公司，SOD、MDA試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，RNA提取試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，PCR引物購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，p-JAK、p-STAT3、β-actin一抗、HRP標(biāo)記二抗購(gòu)自美國(guó)CST公司，ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Amersham公司。

RT-PCR儀、電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司，紫外檢測(cè)儀購(gòu)自上海嘉鵬科技有限公司，渦旋儀器購(gòu)自美國(guó)Thermo公司，凝膠成像儀購(gòu)自南京世研儀器設(shè)備有限公司，小動(dòng)物呼吸機(jī)購(gòu)自美國(guó)Harvard公司，超低溫冰箱購(gòu)自青島海爾股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 制備VILI大鼠模型 采用13.3%烏拉坦與0.5%氯醛糖聯(lián)合注射麻醉大鼠，起效后固定大鼠，對(duì)大鼠皮毛消毒處理，切開氣管，將16 G靜脈穿刺留置導(dǎo)管插入大鼠氣管內(nèi)，連接小動(dòng)物呼吸機(jī)進(jìn)行機(jī)械通氣。假手術(shù)組大鼠麻醉后切開氣管，但不進(jìn)行機(jī)械通氣；模型組潮氣量設(shè)定為30 mL/kg；丙泊酚組在進(jìn)行機(jī)械通氣的同時(shí)靜脈注射丙泊酚，劑量為8 mg·kg-1·h-1，通氣時(shí)長(zhǎng)為2 h[11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，處死大鼠，提取大鼠肺組織，左側(cè)肺組織用4%多聚甲醛溶液固定，右側(cè)肺組織置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，備用。

1.2.2 HE染色法檢測(cè)大鼠VILI情況 將左側(cè)肺組織從4%多聚甲醛中取出，進(jìn)行脫水處理后，用石蠟包埋，切片。然后對(duì)切片進(jìn)行修剪、脫水、二甲苯透明處理，然后用蘇木素溶液、伊紅溶液進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察染色情況。

1.2.3 ELISA法檢測(cè)大鼠肺組織中TNF-α和IL-6含量 將右側(cè)部分肺組織從-80 ℃冰箱中取出后，放室溫平衡30 min，根據(jù)說(shuō)明書要求配制標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋液，計(jì)算蛋白濃度。加入生物素化抗體工作液和酶結(jié)合物工作液，37 ℃恒溫作用90 min。然后，加入洗滌液清洗，甩凈每孔內(nèi)液體，再加入100 μL顯色液，避光孵育15 min，加入50 μL終止液終止反應(yīng)，通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處吸光度。

1.2.4 肺組織SOD和MDA活性的檢測(cè) 取大鼠右側(cè)部分肺組織，在生理鹽水中預(yù)冷去除殘留血，濾紙吸干，用電動(dòng)勻漿器在4 ℃下制成肺組織10%的勻漿。然后以4 000 r/min離心12 min。最后取上清液測(cè)SOD活性及MDA含量。

1.2.5 大鼠肺組織濕/干重比(W/D)檢測(cè) 取大鼠右側(cè)部分肺組織，用冷生理鹽水沖去殘血，濾紙吸干水分，在分析天平上精確稱量作為濕重。然后放入80 ℃烤箱烘干，72 h后稱重作為干重。

1.2.6 RT-PCR法檢測(cè)大鼠肺組織中JAK、STAT3 mRNA水平 用TRIzol裂解液提取各組大鼠肺組織總RNA，之后加入氯仿、預(yù)冷異丙醇，出現(xiàn)棉絮狀白色沉淀后離心，取上清液。并測(cè)得所提RNA質(zhì)量濃度，稀釋至1 μg/μL。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書，對(duì)所提RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后再進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，引物信息見表1。退火溫度為58 ℃，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像儀下觀察電泳結(jié)果。

1.2.7 Western blot法檢測(cè)大鼠肺組織中p-JAK、p-STAT3蛋白水平 稱取100 mg肺組織，用蛋白裂解液裂解，12 000 r/min低溫離心15 min，取上清液。用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，上樣質(zhì)量為50 μg，根據(jù)蛋白濃度加入對(duì)應(yīng)體積。用8%SDS-PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，然后用5%脫脂奶粉溶液封閉1 h，TBST液清洗，然后加入一抗(p-JAK，1∶1 000；p-STAT3，1∶1 000)，4 ℃孵育過(guò)夜。第2天，洗掉一抗后，加入二抗孵育1 h，再用TBST液清洗，使用ECL顯色，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光，觀測(cè)結(jié)果，用ImageJ軟件分析條帶圖。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚降低VILI模型大鼠W/D指數(shù)

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠W/D指數(shù)明顯較高(P<0.05)；與模型組相比，丙泊酚組W/D指數(shù)明顯較低(P<0.05)，說(shuō)明丙泊酚可抑制大潮氣量通氣所致肺組織中水分增加現(xiàn)象(圖1)。

*：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05

2.2 丙泊酚改善大鼠VILI病理學(xué)形態(tài)

HE結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)變化較明顯，肺泡間隔變寬，肺泡中有大量滲液存在，有出血和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；而與模型組相比，丙泊酚組大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)得到明顯改善，說(shuō)明丙泊酚可明顯改善肺泡腔內(nèi)出現(xiàn)的水腫及出血(圖2)。

2.3 丙泊酚減少大鼠肺組織中TNF-α和IL-6含量

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺組織中TNF-α和IL-6含量均明顯較高(P<0.05，P<0.01)；與模型組相比，丙泊酚組大鼠肺組織中TNF-α和IL-6含量均明顯較低(P<0.05)，說(shuō)明丙泊酚可明顯抑制VILI模型大鼠肺組織中炎癥反應(yīng)而發(fā)揮保護(hù)作用(表2)。

圖2 各組大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)(HE染色，×20)

表2 各組大鼠肺組織中TNF-α和IL-6含量

*：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與假手術(shù)組比較，P<0.01；△：與模型組比較，P<0.05

2.4 丙泊酚對(duì)大鼠氧化應(yīng)激的影響

與假手術(shù)組相比，模型組中MDA的含量顯著較高(P<0.05)，而SOD的含量顯著較低(P<0.05)；與模型組相比，丙泊酚組MDA的含量顯著較低(P<0.05)，而SOD的含量顯著較高(P<0.05)，表明丙泊酚有顯著抗氧化應(yīng)激的作用(圖3)。

2.5 丙泊酚抑制大鼠肺組織中JAK、STAT3 mRNA水平

RT-PCR結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺組織中JAK、STAT3 mRNA水平均明顯較高(P<0.05)；而與模型組相比，丙泊酚組大鼠肺組織中JAK、STAT3 mRNA水平均明顯較低(P<0.05)，說(shuō)明丙泊酚可抑制VILI模型大鼠肺組織中JAK、STAT3 mRNA的表達(dá)(圖4)。

a：MDA含量比較；b：SOD活性比較 *：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05

圖3 各組大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)比較

a:RT-PCR結(jié)果；b:RT-PCR定量分析結(jié)果 *：與假手術(shù)組比較，P<0.05；#：與模型組比較，P<0.05

2.6 丙泊酚抑制大鼠肺組織中p-JAK、p-STAT3蛋白磷酸化

Western blot結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠肺組織中p-JAK、p-STAT3蛋白水平均明顯較高(P<0.05)；而與模型組相比，丙泊酚組大鼠肺組織中p-JAK、p-STAT3蛋白水平均明顯較低(P<0.05)，進(jìn)一步說(shuō)明丙泊酚通過(guò)JAK/STAT3信號(hào)通路對(duì)VILI模型大鼠發(fā)揮保護(hù)作用(圖5)。

3 討論

在急救或者危重患者的搶救中，機(jī)械通氣的使用最為普遍、有效，但也會(huì)給患者肺部造成損傷[12-13]。因此，若能通過(guò)藥物治療或逆轉(zhuǎn)VILI的病理過(guò)程，將有助于減輕機(jī)械通氣時(shí)呼吸機(jī)帶來(lái)的副作用，為呼吸機(jī)在臨床應(yīng)用提供理論支持。研究顯示，由于機(jī)械通氣引起氣道壓力的改變，可促進(jìn)肺組織中大量炎癥因子的釋放及中性粒細(xì)胞的聚集，使肺組織出現(xiàn)充血和水腫等情況[14]。VILI的病理學(xué)機(jī)制主要包括氣壓傷和容量傷、萎陷傷、生物傷等，近年來(lái)的研究表明生物傷在VILI的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用[15]。

VILI中表現(xiàn)出大量免疫系統(tǒng)的異常反應(yīng)，與炎癥因子的釋放和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，同時(shí)炎癥反應(yīng)也會(huì)加重VILI[16]。Wang等[17]在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)，VILI大鼠模型中存在異常的炎癥反應(yīng)，利用具有抗炎特性的姜黃素治療后，大鼠VILI減輕，病理學(xué)形態(tài)改善，炎癥因子的釋放和中性粒細(xì)胞的活化減少，其機(jī)制可能與降低肺組織中NF-κB活性有關(guān)。Xia等[18]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一種從松樹皮中提取的黃酮類成分可對(duì)抗VILI，其可使大鼠VILI得到明顯改善，過(guò)氧化物酶活性下降，肺組織中TNF-α、IL-6、IL-1β和MIP-2含量明顯降低，通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)松樹皮中黃酮類成分減輕VILI可能是通過(guò)抑制NF-κB磷酸化，并促進(jìn)IkB-α降解而實(shí)現(xiàn)的。以上結(jié)果說(shuō)明，VILI中有大量異常的炎癥反應(yīng)，若不能及時(shí)抑制，則會(huì)進(jìn)一步加重VILI的發(fā)生及發(fā)展。

JAK/STAT3信號(hào)通路可被多種細(xì)胞因子、炎癥因子、激素、生長(zhǎng)因子激活，進(jìn)而刺激下游靶點(diǎn)，對(duì)生物體的生物過(guò)程或病理過(guò)程發(fā)揮調(diào)控作用[19]。JAK/STAT3信號(hào)通路通過(guò)與細(xì)胞表面受體相結(jié)合，進(jìn)行磷酸化或轉(zhuǎn)磷酸化改變后，活化的JAK促使受體磷酸化，為轉(zhuǎn)錄因子STAT3提供位點(diǎn)，使STAT3二聚化，進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控目的基因的表達(dá)[20]。但是關(guān)于此信號(hào)通路在VILI中的研究卻少有報(bào)道。

本研究利用機(jī)械通氣法制備VILI大鼠模型，發(fā)現(xiàn)大潮氣量通氣可以導(dǎo)致大鼠肺水腫、炎癥因子浸潤(rùn)等病理改變。通過(guò)對(duì)各組大鼠肺組織W/D指數(shù)的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可明顯降低W/D指數(shù)，說(shuō)明丙泊酚可抑制因呼吸機(jī)所致肺水腫。隨后通過(guò)HE染色發(fā)現(xiàn)，丙泊酚治療后大鼠肺組織病理學(xué)形態(tài)得到明顯改善，再利用ELISA法對(duì)肺組織中TNF-α和IL-6含量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)丙泊酚可明顯抑制炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應(yīng)。為了進(jìn)一步探究丙泊酚對(duì)VILI的機(jī)制，本研究利用RT-PCR和Western blot法分別對(duì)JAK、STAT3 mRNA和蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示丙泊酚均可明顯抑制其表達(dá)，說(shuō)明丙泊酚可能通過(guò)抑制JAK/STAT3信號(hào)通路對(duì)VILI模型大鼠發(fā)揮保護(hù)作用。