蔣月麗，李 彤，武予清，苗 進(jìn)，鞏中軍，段 云，劉啟航

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，河南省農(nóng)作物病蟲(chóng)害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部華北南部有害生物治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

麥紅吸漿蟲(chóng)Sitodiplosismosellana(Gehin)屬雙翅目癭蚊科Cecidomyiidae，是一種世界性的小麥害蟲(chóng)，主要分布在美國(guó)、加拿大、歐洲、俄羅斯和中國(guó)(Lambetal., 2000; Berzonskyetal., 2003)，以幼蟲(chóng)潛伏在穎殼內(nèi)吸食正在灌漿的汁液，造成麥粒癟瘡、空殼或霉?fàn)€而減產(chǎn)，具有很大的危害性，一般減產(chǎn)10%～20%，重者減產(chǎn)30%～50%，嚴(yán)重的乃至顆粒無(wú)收，全球每年因麥紅吸漿蟲(chóng)的危害而造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)億美元(Doane and Olfert, 2008; Oakley, 2008)。由于麥紅吸漿蟲(chóng)具有蟲(chóng)體小，在土壤中滯育時(shí)間長(zhǎng)，在田間呈島嶼型分布和發(fā)生危害具有隱蔽性、間歇性和周期性的特點(diǎn)(Wise and Lamb, 2004; Liatukasetal., 2009; 郁振興等，2011)，長(zhǎng)期以來(lái)一直是威脅小麥生產(chǎn)的重要害蟲(chóng)。目前，關(guān)于吸漿蟲(chóng)的研究大多集中在生態(tài)和生物化學(xué)(Hinks and Doane, 1988; Hu and Zhang, 1995; Wise and Lamb, 2004; Wu and Yuan, 2004; Chenetal., 2009)，但是由于基因組和轉(zhuǎn)錄組信息的缺乏，很少有關(guān)于其功能基因的研究，本文通過(guò)獲得大量轉(zhuǎn)錄組信息，可以為其功能基因的挖掘提供巨大的信息資源。

轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)是指細(xì)胞在特定狀態(tài)下全部表達(dá)的RNA的總和，反映相同基因在不同條件下表達(dá)水平的差異，并能揭示不同基因的相互作用及各自功能(Velculescu, 1997)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一門基于轉(zhuǎn)錄組在整體水平之上研究生物基因轉(zhuǎn)錄情況的學(xué)科。近年來(lái)，轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)在揭示細(xì)胞生理活動(dòng)規(guī)律和代謝機(jī)理的研究中廣泛應(yīng)用(Lockhart & Winzeler, 2008)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA sequencing)分為三代。第一代測(cè)序技術(shù)以基因表達(dá)系列分析技術(shù)(Serial Analysis of GeneExpression，SAGE)和大規(guī)模平行測(cè)序技術(shù)(Massively Paralel Signature Sequencing，MPSS)為代表，以雙脫氧終止法(Sangeretal., 1997)和化學(xué)降解法(Whitfeldetal., 1954; Maxametal., 1977)為基礎(chǔ)。第二代測(cè)序技術(shù)—高通量測(cè)序技術(shù)(High-throughput sequencing)主要包括Roche 454焦磷酸測(cè)序技術(shù)、Illumina/Solexa測(cè)序技術(shù)、Solexa測(cè)序技術(shù)和SOLiD測(cè)序技術(shù)等，其原理為提取樣品總RNA后，用高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行樣品文庫(kù)的深度測(cè)序，經(jīng)圖像識(shí)別，獲得DNA序列(張春蘭，2012)。第三代測(cè)序技術(shù)包括Helicos單分子測(cè)序儀、Pacific Bioscience的SMRT技術(shù)以及Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)。其中，Illumina測(cè)序技術(shù)成本低、周期短、通量高，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可用于研究基因功能、可變剪接、新轉(zhuǎn)錄本預(yù)測(cè)和結(jié)構(gòu)性變異(Alagnaetal., 2009; Barakatetal., 2009; Dassanayakeetal., 2010; Lietal., 2010)。相對(duì)于傳統(tǒng)的芯片雜交平臺(tái)，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可對(duì)任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，提供更精確的數(shù)字化信號(hào)，更高的檢測(cè)通量及更廣泛的檢測(cè)范圍。因此，對(duì)于缺乏基因組信息的物種而言，采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可獲得大量的轉(zhuǎn)錄本信息，從中發(fā)掘重要功能基因的重要研究手段(Franssenetal., 2011; 楊楠等，2012；Lietal., 2013)。

本研究中將Illumina HiSeq 2000高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用到麥紅吸漿蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組研究，將測(cè)序得到的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接與組裝，結(jié)合生物信息學(xué)方法對(duì)所獲得的Unigene進(jìn)行基因功能注釋、功能分類、代謝途徑分析等，研究結(jié)果和分析為進(jìn)一步的分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)和基因功能研究奠定基礎(chǔ)，也為麥紅吸漿蟲(chóng)的基因組學(xué)研究提供豐富的資源。

1 材料與方法

1.1 試蟲(chóng)

麥紅吸漿蟲(chóng)土樣，與2014年在河南省新鄉(xiāng)市輝縣采集，將所采集的吸漿蟲(chóng)土樣放入春化室進(jìn)行春化處理，與次年春季移入氣候室，待成蟲(chóng)羽化當(dāng)天收集，選擇健壯活蟲(chóng)經(jīng)處理后，立即放入液氮保存。

1.2 方法

將液氮冷凍保存的試蟲(chóng)送至北京諾禾致源生物信息科技有限公司。使用試劑盒提取RNA。采用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA降解程度以及是否有污染，Nanodrop檢測(cè)RNA的純度(OD260/OD280比值)，Qubit對(duì)RNA濃度進(jìn)行精確定量，Agilent 2100精確檢測(cè)RNA的完整性。將滿足測(cè)序要求的RNA樣本進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及原始數(shù)據(jù)分析。

1.2.1建庫(kù)流程

樣品檢測(cè)合格后，用帶有Oligo (dT)的磁珠富集真核生物mRNA(若為原核生物，則通過(guò)試劑盒去除rRNA來(lái)富集mRNA)。隨后加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物(random hexamers)合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs(dNTP中的dTTP用dUTP取代)和DNA polymerase I和RNase H合成二鏈cDNA，再用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA，之后用USER酶降解含有U的cDNA第二鏈。純化的雙鏈cDNA先進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，再用AMPure XP beads進(jìn)行片段大小選擇。最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，得到最終的文庫(kù)。文庫(kù)構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0進(jìn)行初步定量，稀釋文庫(kù)至1.5 ng/μL，隨后使用Agilent 2100對(duì)文庫(kù)的insert size進(jìn)行檢測(cè)，insert size符合預(yù)期后，使用Q-PCR方法對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量(文庫(kù)有效濃度>2 nM)，以保證文庫(kù)質(zhì)量。庫(kù)檢合格后，把不同文庫(kù)按照有效濃度及目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量的需求pooling后進(jìn)行Illumina HiSeq測(cè)序。

1.2.2轉(zhuǎn)錄組信息分析

1.2.2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)的預(yù)處理

測(cè)序得到的原始測(cè)序序列(Sequenced Reads)或者raw reads，里面含有帶接頭的、低質(zhì)量的reads，為了保證信息分析質(zhì)量，必須對(duì)raw reads過(guò)濾，得到clean reads，后續(xù)分析都基于clean reads。數(shù)據(jù)處理的步驟如下：(1)去除帶接頭(adapter)的reads；(2)去除N(N表示無(wú)法確定堿基信息)的比例大于10%的reads；(3)去除低質(zhì)量reads(質(zhì)量值Qphred <= 20的堿基數(shù)占整個(gè)reads的50%以上的reads)。

1.2.2.2 Trinity拼接

利用Trinity軟件對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行組裝，通過(guò)序列之間的overlap信息組裝得到重疊群(Contig)，然后在局部進(jìn)行組裝得到轉(zhuǎn)錄本(Transcripts)，最后從局部中挑選最主要的轉(zhuǎn)錄本作為單基因簇(Unigene)(Grabherretal., 2011)。

1.2.2.3 轉(zhuǎn)錄本的功能注釋

拼接獲得轉(zhuǎn)錄本后，與7個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)(Nr，Nt，Pfam，KOG/COG，Swiss-Prot，KEGG和GO)。中的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，取閾值e ≤10-10，通過(guò)序列相似性進(jìn)行功能注釋。序列相似性比較使用BLAST(Altschuletal.)算法，然后用WEGO軟件對(duì)所有的Unigene進(jìn)行GO功能分類統(tǒng)計(jì)(Conesaetal., 2005; Yeetal., 2006)。然后對(duì)Unigene分別進(jìn)行蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫(kù)(euKaryotic Ortholog Groups，KOG)功能分類和東京基因與基金組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)代謝途徑分析(Romanetal., 2003; Minoruetal., 2004)。

1.2.2.4 CDS預(yù)測(cè)

CDS預(yù)測(cè)分為兩步：1. 將Unigenes按照NR蛋白庫(kù)，Swissprot蛋白庫(kù)的優(yōu)先級(jí)順序進(jìn)行比對(duì)，若比對(duì)上，則從比對(duì)結(jié)果中提取出轉(zhuǎn)錄本的ORF編碼框信息，并按照標(biāo)準(zhǔn)密碼子表將編碼區(qū)序列翻譯成氨基酸序列(按照5′>3′的順序)；2. 對(duì)于沒(méi)有比對(duì)上NR和Swissprot蛋白庫(kù)的序列，或者比對(duì)上未預(yù)測(cè)出結(jié)果的序列，則采用estscan (3.0.3)軟件預(yù)測(cè)其ORF，從而得到這部分基因編碼的核酸序列和氨基酸序列。

1.2.2.5 SSR分析

利用MISA軟件對(duì)麥紅吸漿蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組中篩選得到1 kb以上的Unigene進(jìn)行簡(jiǎn)單重復(fù)序列(Simple sequence repeats，SSR)位點(diǎn)分析，搜索標(biāo)準(zhǔn)為：?jiǎn)?、二、三、四、五、六核苷酸基?motif)至少重復(fù)次數(shù)分別為10、8、5、4、3、3，對(duì)查找的SSR類型進(jìn)行特征分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 麥紅吸漿蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的組裝

轉(zhuǎn)錄組樣本數(shù)據(jù)量為27.88 G，總的CG含量平均值為40.26%，數(shù)據(jù)中96.70%的序列的質(zhì)量參數(shù)Q≥20，93.53%的Q≥30。經(jīng)過(guò)分析，共獲得59 257個(gè)Unigenes，總長(zhǎng)度49 861 164 bp，最短201 bp，最長(zhǎng)29 282 bp，平均長(zhǎng)度841 bp(圖1)。

2.2 Unigene的功能注釋、分類和代謝途徑分析

2.2.1Unigene在各數(shù)據(jù)庫(kù)中的比對(duì)

將獲得的59 257個(gè)Unigenes分別在7個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行比對(duì)，取閾值e≤10-10，分別獲得18 596、2 868、9 110、14 680、18 912、19 584和11 279個(gè)結(jié)果，共計(jì)95 029個(gè)結(jié)果。

2.2.2Unigene的GO分類注釋

共有19 584個(gè)Unigenes在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中3大類50個(gè)功能組中找到對(duì)應(yīng)(圖2)。其中生物學(xué)進(jìn)程組中較大的是細(xì)胞進(jìn)程(Cellular process)及新陳代謝進(jìn)程(Metabolic process)；細(xì)胞成分組中較大的細(xì)胞(Cell)和細(xì)胞成分(Cell part)；分子功能組中較大的是結(jié)合活性(binging)和催化活性(Catalytic activity)。

圖1 拼接Unigenes與轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度分布圖Fig.1 length distribution of splice Unigenes and transcript

圖2 Unigenes的GO分類圖Fig.2 GO functional categories of unigenes

2.2.3Unigene的KOG分類注釋

蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫(kù)(euKaryotic Ortholog Groups, KOG)是對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫(kù)。將麥紅吸漿蟲(chóng)Unigenes與KOG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，預(yù)測(cè)Unigenes功能并進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)。研究結(jié)果表明，共有11 279個(gè)麥紅吸漿蟲(chóng)Unigenes被注釋，根據(jù)其功能大致可分為26類，對(duì)每類的Unigenes進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析(圖3 A-Z)。從圖中可以看出，Unigenes涉及的KOG功能類別比較全面，涉及了大多數(shù)的生命活動(dòng)。其中，一般功能預(yù)測(cè)類基因最多(2 226個(gè))；其次是信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制類基因(1 467個(gè))、翻譯后修飾，蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶(1 265個(gè))、轉(zhuǎn)錄(734個(gè))；未知蛋白質(zhì)(1個(gè))最少，其他類別的基因表達(dá)豐度都各不相同。

圖3 麥紅吸漿蟲(chóng)Unigenes的KOG分類圖Fig.3 KOG functional categories of Sitodiplosis mosellana Unigenes

2.2.3Unigenes的KEGG分類注釋

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物和化合物在細(xì)胞中的代謝途徑以及這些基因產(chǎn)物的功能的數(shù)據(jù)庫(kù)。它整合了基因組、化學(xué)分子和生化系統(tǒng)等方面的數(shù)據(jù)，包括代謝通路(KEGG PATHWAY)、藥物(KEGG DRUG)、疾病(KEGG DISEASE)、功能模型(KEGG MODULE)、基因序列(KEGG GENES)及基因組(KEGG GENOME)等等。結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)麥紅吸漿蟲(chóng)的Unigene可能參與或涉及的代謝途徑進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，共有9 110個(gè)麥紅吸漿蟲(chóng)Unigenes被注釋，分別歸屬于細(xì)胞進(jìn)程、環(huán)境信息進(jìn)程、遺傳信息進(jìn)程、新陳代謝和有機(jī)體系統(tǒng)五大類代謝途徑，主要包括細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝等32類代謝途徑。其中占比例最高的是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有1 078個(gè)(占11.83%)，其次是轉(zhuǎn)錄有730個(gè)(占8.01%)和折疊、排序與退化有661個(gè)(占7.26%)，比例最小的是生物合成與次生代謝僅有52個(gè)(占0.57%)(圖4)。

2.3 CDS預(yù)測(cè)

CDS預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，共30 088條序列可被編碼，占全部基因的50.78%(30088/59257)。圖5表示所預(yù)測(cè)CDS的長(zhǎng)度統(tǒng)計(jì)。

2.4 微衛(wèi)星位點(diǎn)(SSR)分析

SSR，簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats)，又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列和微衛(wèi)星標(biāo)記。是一類由幾個(gè)核苷酸(1～5個(gè))為重復(fù)單位組成的長(zhǎng)達(dá)幾十個(gè)核苷酸的重復(fù)序列，長(zhǎng)度較短，且廣泛均勻分布于真核生物基因組中(Chambersetal., 2000)。由于重復(fù)單位的次數(shù)不同或重復(fù)程度的不完全相同，造成了SSR長(zhǎng)度的高度變異性，其中最常見(jiàn)的雙核苷酸重復(fù)類型，如(CA) n(Jérmeetal., 2010)。本研究分析中采用MISA 1.0，默認(rèn)參數(shù)；對(duì)應(yīng)的各個(gè)unit size的最少重復(fù)次數(shù)分別為(1～10，2～6，3～5，4～5，5～5，6～5)對(duì)Unigene進(jìn)行SSR檢測(cè)，共檢測(cè)到36 323個(gè)微衛(wèi)星序列，發(fā)生率為61.30%(36 323/59 257)。其中單核苷酸重復(fù)、二核苷酸重復(fù)、三核苷酸重復(fù)、四核苷酸重復(fù)、五核苷酸重復(fù)、六核苷酸重復(fù)微衛(wèi)星序列分別為21 508、9 217、5 290、261、22、25條，依次占微衛(wèi)星序列的59.21%(21 508/36 323)、25.38%、14.56%、0.72%、0.06%、0.07%，其中單核苷酸重復(fù)占比最高，其次是二核苷酸和三核苷酸重復(fù)。并且對(duì)不同SSR類型在基因轉(zhuǎn)錄本的密度分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)(圖6)。

圖4 麥紅吸漿蟲(chóng)Unigenes的KEGG分類圖Fig.4 KEGG functional categories of Sitodiplosis mosellana Unigenes

圖5 麥紅吸漿蟲(chóng)Unigenes的CDS的長(zhǎng)度分布統(tǒng)計(jì)圖Fig.5 Length distribution of CDS of Sitodiplosis mosellana unigenes

圖6 麥紅吸漿蟲(chóng)Unigene的不同SSR類型在基因轉(zhuǎn)錄本的密度分布Fig.6 Density distribution of Unigene SSR in different types gene transcripts of Sitodiplosis mosellana

3 結(jié)論與討論

轉(zhuǎn)錄組學(xué)(Transcriptomics)是功能基因組學(xué)研究的一個(gè)重要內(nèi)容，它是從整體水平上研究細(xì)胞中基因轉(zhuǎn)錄的情況及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律?；诟咄繙y(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)通過(guò)對(duì)組織中的RNA(包括mRNA和非編碼RNA)進(jìn)行測(cè)序，能夠全面快速地獲得某一物種特殊組織或器官在某一特定狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本信息，具有高準(zhǔn)確性、高通量、高靈敏度和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于各種生物轉(zhuǎn)錄組的研究(Shendure, 2008; Grabherretal., 2011; 張春蘭等，2012)。為獲得麥紅吸漿蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組信息，本研究應(yīng)用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)麥紅吸漿蟲(chóng)進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，通過(guò)序列的預(yù)處理Trinity拼接、 轉(zhuǎn)錄本功能注釋等步驟，得到了數(shù)據(jù)量為27.88 G的轉(zhuǎn)錄組信息。大量的麥紅吸漿蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄本信息可為其今后的分子標(biāo)記和功能基因挖掘提供有價(jià)值的信息。

通過(guò)高通量測(cè)序，經(jīng)拼接組裝，共獲得77 500個(gè)轉(zhuǎn)錄本，進(jìn)一步分析獲得59 257個(gè)Unigenes，總長(zhǎng)度49 861 164 bp，最短201 bp，最長(zhǎng)29 282 bp，平均長(zhǎng)度841 bp，N50值為1 802 bp(N50是指將拼接轉(zhuǎn)錄本按照長(zhǎng)度從長(zhǎng)到短排序，累加轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度，到不小于總長(zhǎng)50%的拼接轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度)，N50值越大，反映組裝得到的長(zhǎng)片段越多，組裝效果就越好。測(cè)序數(shù)據(jù)產(chǎn)量和數(shù)據(jù)組裝質(zhì)量是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序完成情況的重要指標(biāo)。以上研究結(jié)果表明，此次序列組裝的質(zhì)量和長(zhǎng)度可以滿足轉(zhuǎn)錄組分析的基本要求，且新一代高通量測(cè)序技術(shù)是批量麥紅吸漿蟲(chóng)功能基因的更為有效手段，進(jìn)一步說(shuō)明Illumina HiSeq 2000是高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的可靠平臺(tái)。

結(jié)合生物信息學(xué)分析方法，對(duì)麥紅吸漿蟲(chóng)Unigene與7個(gè)公共數(shù)據(jù)庫(kù)(Nr，Nt，Pfam，KOG/KOG，Swiss-Prot，KEGG和GO)進(jìn)行比對(duì)，以強(qiáng)大的生物信息學(xué)平臺(tái)作支撐，根據(jù)“基因結(jié)構(gòu)相似，功能同源”的原理，對(duì)基因的功能進(jìn)行注釋。分別獲得18 596、2 868、9 110、14 680、18 912、19 584和11 279個(gè)結(jié)果，共計(jì)95 029個(gè)結(jié)果。表明在對(duì)麥紅吸漿蟲(chóng)基因組不清楚的情況下，高通量測(cè)序技術(shù)是批量發(fā)現(xiàn)麥紅吸漿蟲(chóng)功能基因的有效且簡(jiǎn)易手段。

本研究中利用Nr和SwissProt蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)所獲得的59 257個(gè)Unigenes進(jìn)行BLASTX比對(duì)分析，共有30 088條序列可被編碼，占全部基因的50.78%(30 088/59 257)。29 169個(gè)Unigenes與其它物種蛋白序列無(wú)匹配，占總體的49.22%，此部分Unigenes主要包括以下3種類型：(a)Unigenes序列片段長(zhǎng)度過(guò)短，不能獲得同源性比對(duì)結(jié)果；(b)基因注釋信息的暫時(shí)缺乏。昆蟲(chóng)基因組學(xué)及轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究剛剛起步，生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)仍在不斷更新和完善中，基因功能注釋信息不全會(huì)造成部分序列暫時(shí)無(wú)法獲得對(duì)應(yīng)的功能注釋信息；(c)昆蟲(chóng)特有的新基因，可能存在一些昆蟲(chóng)特有的新基因，這或許也是導(dǎo)致其同源序列較難發(fā)現(xiàn)的原因之一。隨著今后研究的深入，進(jìn)一步將麥紅吸漿蟲(chóng)與其它昆蟲(chóng)進(jìn)行比較分析，為研究昆蟲(chóng)的分子生物學(xué)提供更為重要的信息。SSR分子標(biāo)記具有操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、多態(tài)性豐富、遺傳信息量大和共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，已在遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、功能基因發(fā)掘、分子標(biāo)記輔助育種等研究中得到了廣泛應(yīng)用(宋建等，2006；Yangetal., 2009; 劉峰等，2012)。采取實(shí)驗(yàn)室手段開(kāi)發(fā)SSR引物費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、成本高且試驗(yàn)復(fù)雜，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)信息進(jìn)行SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)將是一種既經(jīng)濟(jì)又有效的方法。本研究通過(guò)查找發(fā)現(xiàn)了36 323個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR不但出現(xiàn)頻率高(發(fā)生率為61.30%)，而且類型豐富。目前，已經(jīng)有很多研究者通過(guò)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)掘分子標(biāo)記(Zhaietal., 2013; Lietal., 2016)，解決了傳統(tǒng)開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記的方法耗時(shí)長(zhǎng)、成本高的問(wèn)題。本研究將為麥紅吸漿蟲(chóng)后續(xù)分子鑒定、多態(tài)性檢測(cè)和種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究提供一定的參考價(jià)值。

本研究采用Illumina HiSeq 2000高通量測(cè)序技術(shù)建立了麥紅吸漿蟲(chóng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得了大量的轉(zhuǎn)錄本信息，并對(duì)表達(dá)基因進(jìn)行了序列組裝、功能注釋及代謝途徑等分析，為今后更深入研究麥紅吸漿蟲(chóng)功能基因組、基因克隆及麥紅吸漿蟲(chóng)抗蟲(chóng)品種的研究提供了大量的信息資源，該轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)也還可以作為今后基因組的參考序列，為麥紅吸漿蟲(chóng)的分子生物學(xué)研究提供寶貴的基因組數(shù)據(jù)來(lái)源。