楊富雅，趙麗華，孫堯，呂偲丞，高冷，*

（1.長(zhǎng)春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130012；2.長(zhǎng)春金荷藥業(yè)有限公司，吉林長(zhǎng)春130012）

梅花鹿（Cervus nippon）是一種珍貴的、具有藥用價(jià)值的特種動(dòng)物，隨著我國(guó)鹿業(yè)市場(chǎng)的逐步成熟，市場(chǎng)對(duì)鹿茸、鹿胎等產(chǎn)品需求量的增加[1]，特別是隨著市場(chǎng)對(duì)鹿產(chǎn)品需求量的提高，在生產(chǎn)過(guò)程中，產(chǎn)生了大量的與梅花鹿相關(guān)的生產(chǎn)廢物，其中主要為鹿脂肪中的油脂，也就是鹿油。經(jīng)相關(guān)報(bào)道，鹿油易被皮膚吸收，不僅能夠保濕鎖水、滋養(yǎng)肌膚，還具有抗氧化的作用，可以延緩皮膚衰老、預(yù)防皮膚疾病，此外對(duì)動(dòng)脈硬化及老年性肥胖癥的預(yù)防也是有幫助的，因此廣泛應(yīng)用于食品[2]、保健品及化妝品[3]等領(lǐng)域。目前，我國(guó)對(duì)鹿油研究較少，對(duì)鹿油成分分析鮮有相關(guān)報(bào)道。

CO2是一種無(wú)毒、純度高、可再循環(huán)利用的溶劑，是超臨界流體提取技術(shù)最常用的溶劑[4-5]。與常見(jiàn)的有機(jī)溶劑提取法相比，超臨界流體提取物中沒(méi)有溶劑殘留，同時(shí)CO2的臨界壓力與臨界溫度較為溫和，提取過(guò)程可以在較低的壓力溫度下進(jìn)行，不會(huì)對(duì)熱敏性物質(zhì)產(chǎn)生影響，更不會(huì)引起部分物質(zhì)的氧化[6]。作為一種環(huán)境友好型技術(shù)，超臨界流體提取被應(yīng)用于各種科學(xué)和工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域[7]。張承紅等[8]研究了超臨界二氧化碳萃取牛尾獨(dú)活揮發(fā)油的工藝條件，探究了不同提取條件對(duì)牛尾揮發(fā)油提取率的影響。由于氣相色譜-質(zhì)譜法（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用的靈敏度較高、抗干擾能力強(qiáng)，在化學(xué)、生物領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。楊君[9]主要通過(guò)GC-MS 分析法檢測(cè)植物油中多環(huán)芳烴的含量，優(yōu)化了檢測(cè)的工藝條件。并且研究經(jīng)過(guò)脫酸、脫色和脫臭加工工序后多環(huán)芳烴的含量變化情況。現(xiàn)階段，運(yùn)用此方法檢測(cè)動(dòng)物油脂主要成分的研究相對(duì)較少。

本研究考察了不同的提取因素對(duì)鹿油提取率的影響。以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究各因素之間的交互作用，特別是提取溫度與提取壓力對(duì)超臨界流體溶解度和傳質(zhì)系數(shù)的交互影響。此外對(duì)超臨界CO2提取鹿油進(jìn)行極差分析，利用極差分析確定不同因素對(duì)鹿油提取率的影響強(qiáng)弱，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)GC-MS 對(duì)鹿油的成分進(jìn)行檢測(cè)，鑒定其主要成分，為更好的開(kāi)發(fā)并應(yīng)用鹿油創(chuàng)造了條件。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

梅花鹿鹿肉脂肪：吉林省雙陽(yáng)區(qū)鹿鄉(xiāng)鎮(zhèn)。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

CO2鋼瓶（40L）：沈陽(yáng)鑫東基化工氣體有限公司；正己烷（分析純）：天津市富宇精細(xì)化工有限公司；氫氧化鈉、甲醇、乙醚、氫氧化鉀、氯化鈉（分析純）：北京化工廠。

1.1.3 試驗(yàn)儀器設(shè)備

氣質(zhì)聯(lián)用儀（SCION SQ）：上海冉超光電科技有限公司；超臨界CO2提取儀（HA221-50-06）：江蘇華安科技有限公司；真空干燥箱（DZ-2AII）：南京諾泰施格科學(xué)儀器有限公司；超聲波清洗器（SCIENTZ-HF2000）：寧波新芝生物科技股份有限公司；電子天平（HX2002T）：慈溪市天東衡器廠。

1.2 方法

1.2.1 原料預(yù)處理

將新鮮鹿脂肪除雜破碎放至超聲波清洗儀（40 kHz，30 ℃下超聲清洗30 min）中清洗，再進(jìn)行真空干燥，相對(duì)真空度0.09 MPa，溫度90 ℃干燥至表面不含水分，放置備用。

1.2.2 工藝流程與操作流程

鹿脂肪→除雜破碎→超聲清洗→干燥脫水→裝料→超臨界CO2提取→鹿油

稱取500.00 g 經(jīng)過(guò)預(yù)處理的鹿脂肪原料裝入萃取釜中，加蓋擰緊，裝入反應(yīng)容器中，升溫，加壓，調(diào)節(jié)CO2流量，提取一定時(shí)間后收集鹿油。

鹿油提取率公式：

式中：X 為鹿油的提取率，%；m1為提取出鹿油的質(zhì)量，g；m2為鹿脂肪的質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

提取溫度的優(yōu)化：稱取500.00 g 預(yù)處理過(guò)的鹿脂肪原料，以鹿油提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，控制提取時(shí)間120 min，提取壓力 40 MPa，CO2流量 12 L/h 恒定不變，改變提取溫度分別為 30、35、40、45、50、55 ℃和 60 ℃，采用超臨界CO2提取法提取鹿油，研究提取溫度對(duì)鹿油提取率的影響。

提取壓力的優(yōu)化：稱取500.00 g 預(yù)處理過(guò)的鹿脂肪原料，以鹿油提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，控制提取時(shí)間120 min，提取溫度 40 ℃，CO2流量 12 L/h 恒定不變，改變提取壓力分別為 25、30、35、40、45、50、55 MPa，采用超臨界CO2提取法提取鹿油，研究提取壓力對(duì)鹿油提取率的影響。

提取時(shí)間的優(yōu)化：稱取500.00 g 預(yù)處理過(guò)的鹿脂肪原料，以鹿油提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，控制提取溫度40 ℃，提取壓力 40 MPa，CO2流量 12 L/h 恒定不變，改變提取時(shí)間分別為 30、60、90、120、150、180、210 min，采用超臨界CO2提取法提取鹿油，研究提取時(shí)間對(duì)鹿油提取率的影響。

CO2流量的優(yōu)化：稱取500.00 g 預(yù)處理過(guò)的鹿脂肪原料，以鹿油提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，控制提取時(shí)間120 min，提取溫度40 ℃，提取壓力40 MPa，改變CO2流量分別為 8、10、12、14、16、18、20 L/h，采用超臨界CO2提取法提取鹿油，研究CO2流量對(duì)鹿油提取率的影響。

1.2.4 正交試驗(yàn)

影響超臨界CO2提取的因素有很多，提取溫度、提取壓力、提取時(shí)間、CO2流量是影響超臨界CO2提取法提取率的重要因素。在單因素變量條件下篩選出提取溫度、提取壓力、提取時(shí)間、CO2流量對(duì)提取率的影響水平，進(jìn)行L9（34）試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以提取率為檢驗(yàn)指標(biāo)，進(jìn)行正交試驗(yàn)，進(jìn)料500.00 g，見(jiàn)表1。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 L9（34）orthogonal experiment factors and levels

1.3 試驗(yàn)方案

1.3.1 鹿油樣品前處理

準(zhǔn)確稱取提取后的鹿油0.200 0 g，加入正己烷使鹿油完全溶解并定容至10.00 mL 容量瓶中，搖勻后用移液槍移取 50 μL 于 10 mL 試管中，加入 0.4 mol/L 的氫氧化鈉-甲醇溶液2.00 mL 后，放置在漩渦振蕩器中，振蕩2 min，放置10 min 后再加入1.95 mL 正己烷于試管中，再將其放入旋渦振蕩器振蕩2 min，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8.0 %的氯化鈉溶液稀釋至10 mL，以2 000 r/min 離心10 min 后吸出上清液于微量試管中，過(guò)0.45 μm 的微孔濾膜過(guò)濾后，再經(jīng)過(guò)三氟化硼法進(jìn)行脂肪酸的甲酯化處理[10]，最后取1 μL 樣品進(jìn)行GCMS 分析。

1.3.2 色譜條件

DB-5MS 毛細(xì)管柱（30 mm×0.25 μm×0.25 nm），進(jìn)樣口溫度 250 ℃；程序升溫：90 ℃持續(xù) 1 min，以 5 ℃/min至 140 ℃，再以 3 ℃/min 至 170 ℃，持續(xù) 1 min，最后以10 ℃/min 至 250 ℃，持續(xù) 5 min。載氣：高純氦氣；流量1 mL/min；分流比 40 ∶1。

1.3.3 質(zhì)譜條件

EI+離子源，離子能量70 eV；燈絲流量0.2 mA；離子源溫度：230 ℃；接口溫度：250 ℃；掃描質(zhì)量范圍：10 amu～550 amu。

1.3.4 圖譜分析

樣品經(jīng)過(guò)GC-MS 分析后，以峰的保留時(shí)間及譜庫(kù)檢索進(jìn)行定性分析，然后與相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)峰面積進(jìn)行比較完成定量分析得出鹿油主要的化學(xué)成份。

2 結(jié)果與分析

2.1 超臨界CO2提取條件單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度對(duì)鹿油提取率的影響

溫度對(duì)鹿油提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 溫度對(duì)鹿油提取率的影響Fig.1 Effect of temperature on extraction rate of deer oil

由圖1 可得，在提取時(shí)間120min，提取壓力40MPa，CO2流量12 L/h 恒定不變的條件下，隨著提取溫度的升高，鹿油的提取率上升趨勢(shì)顯著，當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最高。隨著溫度高于45 ℃時(shí)，提取率開(kāi)始緩慢下降。

由于溫度升高對(duì)對(duì)流傳質(zhì)系數(shù)的影響大于對(duì)溶解度的影響，提取率不斷提升。而當(dāng)溫度高于45 ℃時(shí)，溶解度對(duì)鹿油提取率的影響高于對(duì)流傳質(zhì)系數(shù)的影響，提取率便開(kāi)始下降。綜合考量得出，鹿油提取溫度以 40 ℃～50 ℃為最佳。

2.1.2 提取壓力對(duì)鹿油提取率的影響

提取壓力對(duì)鹿油提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 壓力對(duì)鹿油提取率的影響Fig.2 Effect of pressure on extraction rate of deer oil

如圖2 可得，壓力變化對(duì)鹿油提取率的影響較為明顯。本試驗(yàn)中，控制提取溫度為40 ℃，壓力從25 MPa上升至40 MPa，鹿油提取率顯著增加，當(dāng)提取壓力超過(guò)40 MPa，鹿油的提取率上升緩慢，但仍具有持續(xù)上升的趨勢(shì)。

從量化生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)方面考慮，當(dāng)壓力高于40 MPa，提取系統(tǒng)需要經(jīng)過(guò)特殊設(shè)計(jì)，會(huì)提高成本。從能源、經(jīng)濟(jì)等綜合因素考量，鹿油提取壓力以35 MPa～45 MPa為最佳。

2.1.3 提取時(shí)間對(duì)鹿油提取率的影響

提取時(shí)間對(duì)鹿油提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 時(shí)間對(duì)鹿油提取率的影響Fig.3 The effect of time on extraction rate of deer oil

如圖3 可得，提取時(shí)間對(duì)超臨界CO2提取鹿油有顯著影響。超臨界提取屬于擴(kuò)散過(guò)程，需要一定時(shí)間才能提取充分。提取初期，由于溶劑的擴(kuò)散速率緩慢，提取率較低，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，溶劑擴(kuò)散能力增強(qiáng)，提取率不斷增大。在控制提取溫度40 ℃、提取壓力40 MPa、CO2流量12 L/h 條件下，觀察圖3 可知，在30 min～150 min 時(shí)間內(nèi)，提取時(shí)間越長(zhǎng)鹿油提取率越高，鹿油提取率隨著提取時(shí)間的增加而顯著提高，但150 min后，隨著提取時(shí)間的增加鹿油提取率基本趨于平緩，由此得到鹿油提取時(shí)間以120 min～180 min 為最佳。

2.1.4 CO2流量對(duì)鹿油提取率影響

CO2流量對(duì)鹿油提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 CO2 流量對(duì)鹿油提取率的影響Fig.4 Effect of CO2 flow on extraction rate of deer oil

本試驗(yàn)中，各組試驗(yàn)控制在提取時(shí)間120 min，提取溫度40 ℃，提取壓力40 MPa 下進(jìn)行，增大CO2流量，意味著更多CO2參與提取過(guò)程。如圖4 可得，當(dāng)CO2流量增大，萃取釜入口處的CO2流速增大，萃取釜中CO2的流動(dòng)方向由于卷吸效應(yīng)發(fā)生彎曲，CO2流量越大，卷吸效應(yīng)越強(qiáng)，使得萃取釜中的原料與超臨界CO2充分反應(yīng)，使提取速率不斷升高。綜合考量得出，鹿油提取中CO2流量以12 L/h～16 L/h 為最佳。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的的正交設(shè)計(jì)方案，在9 種不同工藝條件下提取鹿油，分別測(cè)定其提取率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experiment results

表2 的極差分析結(jié)果表明，超臨界提取4 個(gè)因素對(duì)鹿油提取率的影響順序?yàn)椋禾崛毫Γ咎崛r(shí)間＞CO2流量＞提取溫度，鹿油的最佳提取方案為A2B2C2D2，即最佳提取工藝條件組合為提取溫度45 ℃，提取時(shí)間150 min，CO2流量 14 L/h，提取壓力 40 MPa。

2.3 最佳提取條件驗(yàn)證

在上述最佳條件下進(jìn)行3 次重復(fù)試驗(yàn)，其鹿油提取率分別為44.36%、45.21%和44.87%，得到平均提取率為44.81%，由提取率可看出，最佳提取工藝條件具有較好的重復(fù)性，鹿油提取率較高，說(shuō)明該工藝條件是合理、可靠的。

2.4 鹿油成分分析

采用GC-MS 分析法對(duì)超臨界CO2提取法所得到的鹿油脂肪酸甲酯液進(jìn)行分析，得鹿油脂肪酸甲酯色譜圖，如圖5 所示。

將質(zhì)譜圖中的各色譜峰與譜圖庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)譜圖進(jìn)行對(duì)照，確定其化學(xué)成分，同時(shí)采用面積歸一化法定量分析計(jì)算出各成分的相對(duì)含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3 可知，鹿油中共鑒定出16 種脂肪酸，其飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸相對(duì)含量分別為69.840 9%、30.159 1%，不飽和脂肪酸/飽和脂肪酸為0.431 8。

圖5 鹿油脂肪酸甲酯色譜圖Fig.5 Fatty acids methyl esters chromatogram of deer oil

表3 鹿油脂肪酸成分與含量Table 3 Compositions and contents of fatty acids in deer oil

其中主要脂肪酸為十六烷酸、十八烷酸、十八碳烯酸及十八碳二烯酸。十六烷酸又稱粽櫚酸，在飽和脂肪酸中含量最高，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為48.85%，穩(wěn)定性良好，是較好的食品強(qiáng)化劑和乳化劑，深受食品制造產(chǎn)業(yè)所喜愛(ài)，粽櫚酸在洗滌用品領(lǐng)域也有廣泛應(yīng)用，主要用于制作肥皂和合成洗滌劑的原料；十八烷酸又稱硬脂酸，是飽和的高級(jí)脂肪酸中的一種，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15.03%，具有很好的潤(rùn)滑性和熱穩(wěn)定性，在食品工業(yè)中用作潤(rùn)滑劑、消泡劑及食品添加劑，在護(hù)膚品中起乳化作用，是化妝品的主要原料；十八碳烯酸又稱油酸，在不飽和脂肪酸中含量最高，占總脂肪酸含量的13.83%，油酸的鈉鹽或鉀鹽是肥皂的主要成分之一。純的油酸鈉具有良好的去污能力，可用作乳化劑等表面活性劑，并可用于治療膽石癥等。此外十八碳烯酸還可用作抗靜電劑、柔軟潤(rùn)滑劑及乳化劑等，因此在化妝品和毛紡等工業(yè)中有廣泛應(yīng)用。根據(jù)GC-MS分析法檢測(cè)的鹿油脂肪酸成分中，十七碳烯酸是不飽和脂肪酸中含量較少的，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.633 4%，在總脂肪酸中含量極低，對(duì)皮膚的刺激作用也就越小。

3 結(jié)果與討論

采用超臨界二氧化碳提取法提取鹿油，通過(guò)單因素試驗(yàn)得到最優(yōu)的提取工藝。提取工藝為提取溫度45 ℃、提取壓力 40 MPa，提取時(shí)間 150 min，CO2流量14 L/h。此時(shí)鹿油的提取率為44.81%。

采用GC-MS 分析法對(duì)鹿油脂肪酸甲酯液的成分進(jìn)行檢測(cè)，確定其含有16 種脂肪酸，其中飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸相對(duì)含量分別為69.840 9%、30.159 1%，主要脂肪酸有十六烷酸、十八烷酸、十八碳烯酸及十八碳二烯酸。與井銀成等[11]研究的豬油、雞油主要脂肪酸含量相比較由超臨界二氧化碳提取法對(duì)提取出的鹿油經(jīng)甲酯化后，通過(guò)GC-MS 分析法檢測(cè)，得到鹿油較其它油脂中的十六烷酸、十八烷酸、十八碳烯酸含量較高，其中十六烷酸含量為48.85%，高于井銀成等[11]報(bào)道的從豬油中提取出的十六烷酸含量，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28.81%，鹿油中十八烷酸為15.03%，高于豬油中的9.01%，同時(shí)十七碳烯酸含量較低僅為0.633 4%。鹿油通過(guò)超臨界CO2提取法提取出的鹿油具有明顯的熱穩(wěn)定性、潤(rùn)滑性、乳化作用較其它同類動(dòng)物油脂效果更好，對(duì)皮膚刺激性更小，更適用于日化領(lǐng)域的應(yīng)用。