王銳麗，段鴻斌，李盡哲，殷東林

（信陽農(nóng)林學院生物與制藥工程學院，河南信陽464000）

牛樟芝簡稱“樟芝”，學名為Antrodia camphorata，俗名牛樟菇、紅樟芝、血靈芝等，屬于多孔菌科、多孔菌屬的珍稀藥用真菌[1]。由于牛樟芝對寄生主很挑剔，且屬于多年生植物，數(shù)量稀少，采集不易，價值遠遠凌駕于靈芝、冬蟲夏草、人參等名貴中藥材之上，被稱之為“森林中的紅寶石”[2]。至2012 年從牛樟芝中已分離得到225 種生理活性成分，如多糖、萜類化合物（單萜、二萜、羊毛甾烷型三萜、麥角甾烷型三萜、甾體等）、免疫蛋白、維生素、微量元素鍺、腺苷、凝集素、馬來酸、琥珀酸衍生物、血壓穩(wěn)定物質(zhì)等[3]，其中菌體中三萜類化合物種類就達幾十種。這些生理活性成分具有抗氧化、抗腫瘤、保肝、解毒、解酒、抗肝、消炎、抗過敏、降“三高”等重要功效[4-7]，可廣泛應用于醫(yī)藥、食品、化妝品、飼料、日化等領域。

由于牛樟芝生長環(huán)境的特殊性，生長周期長，野生資源枯竭，故其大規(guī)模的開發(fā)應用受到了極大的限制。目前，對于牛樟芝人工培育的研究多集中在利用正交試驗或響應面法優(yōu)化牛樟芝液體發(fā)酵條件[8]，及以樟芝胞外多糖和胞內(nèi)多糖為目的產(chǎn)物，探索樟芝液體發(fā)酵的培養(yǎng)基配方組成[9]。牛樟芝人工培育技術大致可以分為液體發(fā)酵法、固體培養(yǎng)法、椴木栽培法3 種[10]。通過液態(tài)發(fā)酵可以在短時間內(nèi)大量獲得牛樟芝菌絲體，是最有效的大規(guī)模人工培養(yǎng)方式，這種方法生產(chǎn)效率高、穩(wěn)定，也比較容易推廣。針對牛樟芝液態(tài)發(fā)酵的研究集中在提高菌體量、多糖產(chǎn)量方面，同時對多糖提取工藝、藥理活性等也有研究[11-13]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，菌株不同，其生物量、多糖和三萜的產(chǎn)量相差比較大，說明菌株和培養(yǎng)條件對樟芝代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)量影響較大[14-15]。

本項目以牛樟芝為研究對象，采用篩選試驗（Plackett-Burman，PB）[16]和中心組合設計（central composite design，CCD）試驗[17]對其高產(chǎn)三萜類化合物培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以期獲得生產(chǎn)三萜類化合物的最佳培養(yǎng)基配方，為進一步大規(guī)模的牛樟芝深層發(fā)酵培養(yǎng)提供指導作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

牛樟芝（Antrodia camphorata）信陽農(nóng)林學院生物與制藥工程學院微生物實驗室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）：200 g/L 馬鈴薯，20 g/L葡萄糖，15 g/L 瓊脂，pH 自然。

種子液培養(yǎng)基：200 g/L 馬鈴薯，20 g/L 葡萄糖，5 g/L蛋白胨，1 g/L MgSO4，2 g/L KH2PO4，50 mg/L VB1。

基本發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g/L 葡萄糖，10 g/L 大豆粉，10 g/L 玉米粉，5 g/L 酵母粉，5 g/L 牛肉膏，10 g/L 黃豆粉，5 g/L 蛋白胨，1 g/L MgSO4，2 g/L KH2PO4，50 mg/L VB1。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

采用二級發(fā)酵法獲得菌絲體[18]。將活化的斜面菌種接入種子液培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min 培養(yǎng)4 d 后，再以10%接種量接入裝有基本發(fā)酵培養(yǎng)基或優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，28 ℃、200 r/min 培養(yǎng) 10 d。用 6 層紗布減壓過濾收集菌絲體，用蒸餾水沖洗3 次，于55 ℃烘干至恒重。

1.2.2 三萜化合物含量測定

以齊墩果酸為標準物，用香草醛-高氯酸法在550 nm 波長下繪制標準曲線。牛樟芝菌絲體中總三萜化合物提取和含量測定參照文獻[19]進行。

1.2.3 PB 試驗分析

選用 N=12 的 Plackett-Burman（PB）試驗設計考察基本發(fā)酵培養(yǎng)基的8 個組分對總三萜含量的影響，PB試驗設計的因素和水平如表1，其他3 個組分的濃度不變。設3 次重復試驗，平行試驗3 組，數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示。應用Design Expert 8.0.6（Stat-Ease Inc，Minneapolis，USA）軟件進行數(shù)據(jù)分析，篩選出對牛樟芝菌絲體產(chǎn)三萜影響顯著的主要因素。

表1 PB 試驗因素與水平設計Table 1 Factors and levels for Plackett-Burman（PB）design

1.2.4 最陡爬坡試驗

對PB 試驗篩選出的主要因素進行最陡爬坡試驗，能最大限度逼近各因素的最大響應區(qū)域。

1.2.5 響應面分析法

根據(jù)CCD 的中心組合試驗設計原理，進行三因素三水平的響應面分析試驗，使用Design Expert 8.0.6 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行二次回歸擬合，模型建立及方差分析。

1.2.6 擬合度試驗

進行擬合度試驗，主要因素采用響應面預測的最佳濃度，分析真實值和預測值之間的擬合度，驗證所建回歸模型的適用性和可靠性。數(shù)據(jù)分析通過Excel 2010 處理，統(tǒng)計學分析通過DPS 7.05 軟件處理，利用Design-expert 8.0.6 軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 PB試驗結果及分析

PB 試驗設計及試驗結果見表2，獲得的三萜含量為（6.86±0.17～13.54±0.34）mg/g。采用基本發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的牛樟芝菌絲體中三萜含量為（12.29±0.43）mg/g。使用Design Expert 8.0.6 對表2 的試驗數(shù)據(jù)進行擬合，其因素奉獻率及方差分析結果如表3。該模型P 值為0.015 4，達到顯著水平，說明模型擬合良好。校正決定系數(shù)Radj2為0.933 9，說明有93.39%的試驗數(shù)據(jù)的變異性可用該模型進行解釋。

玉米粉（X3）和黃豆粉（X6）對三萜總含量的影響極顯著（P＜0.01），牛肉膏（X5）對三萜總含量的影響顯著（P＜0.05）。因此把 X3、X5、X63 個因素視為影響牛樟芝菌絲體三萜含量的主要因素。由表3 可知在顯著因素中，因素X3和X5的回歸系數(shù)為負數(shù)，說明它們對三萜總含量的影響為負效應，在最陡爬坡試驗中應降低其添加量，因素X6的系數(shù)為正值，后續(xù)應提高其添加量。依據(jù)表3 貢獻率及相關系數(shù)的大小分析，后續(xù)試驗不再添加次要因素酵母粉和蛋白胨，葡萄糖及大豆粉濃度分別確定為20、10 g/L。

表2 PB 試驗設計及試驗結果Table 2 Design of PB test and corresponding results

2.2 最陡爬坡試驗結果

對玉米粉（X3）、牛肉膏（X5）和黃豆粉（X6）3 個顯著因素進行最陡爬坡試驗，X3、X5、X6的步長分別為 6、1、5 g/L，步長的計算方法參照[20]，具體試驗編碼及結果如表4。

表4 最陡爬坡試驗的設計及結果Table 4 Steepest ascent design and results

由表4 可知，三萜化合物總含量在第4 組試驗中達到最高，因此以該組對應的玉米粉含量（18 g/L）、牛肉膏（4.5 g/L）和黃豆粉（30 g/L）作為后續(xù)響應面試驗的中心點。

2.3 響應面優(yōu)化試驗結果及分析

2.3.1 中心組合設計及結果

采用CCD 試驗設計對影響牛樟芝菌絲體產(chǎn)三萜化合物的3 個顯著因素：玉米粉含量（X3）、牛肉膏含量（X5）和黃豆粉含量（X6）進行三因素三水平的響應面分析試驗，以產(chǎn)生的三萜含量（Y）為響應值，選擇6 個中心點試驗組以估計誤差，星號臂長（γ）值為1.682，CCD試驗設計及結果見表5。

表5 中心組合試驗設計及結果Table 5 Central composite design and results

2.3.2 回歸模型的建立及方差分析結果

應用Design Expert 8.0.6 對表5 的試驗數(shù)據(jù)進行擬合，得到二次多項回歸模型如下響應面二項模型的方差分析見表6。

表6 響應面二項模型的方差分析Table 6 ANOVA table for response surface quadratic model

續(xù)表6 響應面二項模型的方差分析Continue table 6 ANOVA table for response surface quadratic model

由表6 的方差分析結果可知，回歸模型P＜0.000 1，達到極顯著水平；失擬項P=0.249 6，不顯著；決定系數(shù)R2=0.962 9，表明該模型擬合度良好；校正決定系數(shù)=0.929 6，表明大約有93%的響應值（Y）變化可以用該模型進行解釋。一次項X3、X6，二次項和對模型影響極顯著，交互項X3X6影響顯著，其余項影響不顯著。

2.3.3 響應面分析與優(yōu)化

分別將玉米粉（X3）、牛肉膏（X5）和黃豆粉（X6）中的一個因子固定在中心點水平（0 水平），直觀分析另外兩個因素及其交互作用對響應值影響效果的大小，其回歸模型的等高線及其響應面如圖1～圖3 所示。

圖1 玉米粉和牛肉膏交互影響三萜含量的響應面和等高線Fig.1 Response surface plots（left）and contour line（right）of effects of interactions between corn flour and beef extract on the triterpenoid content

圖2 玉米粉和黃豆粉交互影響三萜含量的響應面和等高線Fig.2 Response surface plots（left）and contour line（right）of effects of interactions between corn flour and soybean meal on the triterpenoid content

圖3 牛肉膏和黃豆粉交互影響三萜含量的響應面和等高線Fig.3 Response surface plots（left）and contour line（right）of effects of interactions between beef extract and soybean meal on the triterpenoid content

圖2 的等高線密集，呈橢圓形，說明X3和X6的交互作用顯著。由圖1 和圖3 可知X3和X5及X5和X6的交互作用不顯著。

應用Design Expert 8.0.6 軟件對所建模型進行參數(shù)優(yōu)化分析，玉米粉濃度為16.07 g/L，牛肉膏為4.5 g/L，黃豆粉為31.93 g/L，此時最大響應值為15.46 mg/g。最終確定優(yōu)化后培養(yǎng)基配方為：20 g/L 葡萄糖，10 g/L 大豆粉，16.07 g/L 玉米粉，4.5 g/L 牛肉膏，31.93 g/L 黃豆粉，1 g/L MgSO4，2 g/L KH2PO4，50 mg/L VB1。

2.4 擬合度驗證

用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方進行牛樟芝發(fā)酵培養(yǎng)，取3次重復試驗的平均值，牛樟芝菌絲體三萜化合物含量為（15.40±0.15）mg/g，與模型預測值 15.46 mg/g 非常接近，與預測值擬合度良好，說明上述模型能較好地預測菌絲體實際生產(chǎn)的三萜含量。

3 結論

本研究對牛樟芝菌絲體發(fā)酵產(chǎn)總三萜類化合物的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，通過PB 法篩選出玉米粉、牛肉膏、黃豆粉為影響總三萜含量的3 個主要因素。根據(jù)CCD 中心組合試驗及三因素三水平的響應面分析，優(yōu)化得到菌絲體高產(chǎn)三萜的最佳培養(yǎng)基：20 g/L 葡萄糖，10 g/L 大豆粉，16.07 g/L 玉米粉，4.5 g/L 牛肉膏，31.93 g/L 黃豆粉，1 g/L MgSO4，2 g/L KH2PO4，50 mg/L VB1。采用基本發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)牛樟芝其菌絲體中總三萜含量為（12.29±0.43）mg/g，經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化處理后三萜類含量為（15.40±0.15）mg/g，相比初始其產(chǎn)量提高了25.3%。說明響應面法可用來優(yōu)化牛樟芝菌絲體高產(chǎn)三萜類化合物的培養(yǎng)基配方，為進一步大規(guī)模的牛樟芝深層發(fā)酵培養(yǎng)具有一定的參考價值。