王銳麗，段鴻斌，李盡哲，殷東林

（信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院，河南信陽(yáng)464000）

牛樟芝簡(jiǎn)稱(chēng)“樟芝”，學(xué)名為Antrodia camphorata，俗名牛樟菇、紅樟芝、血靈芝等，屬于多孔菌科、多孔菌屬的珍稀藥用真菌[1]。由于牛樟芝對(duì)寄生主很挑剔，且屬于多年生植物，數(shù)量稀少，采集不易，價(jià)值遠(yuǎn)遠(yuǎn)凌駕于靈芝、冬蟲(chóng)夏草、人參等名貴中藥材之上，被稱(chēng)之為“森林中的紅寶石”[2]。至2012 年從牛樟芝中已分離得到225 種生理活性成分，如多糖、萜類(lèi)化合物（單萜、二萜、羊毛甾烷型三萜、麥角甾烷型三萜、甾體等）、免疫蛋白、維生素、微量元素鍺、腺苷、凝集素、馬來(lái)酸、琥珀酸衍生物、血壓穩(wěn)定物質(zhì)等[3]，其中菌體中三萜類(lèi)化合物種類(lèi)就達(dá)幾十種。這些生理活性成分具有抗氧化、抗腫瘤、保肝、解毒、解酒、抗肝、消炎、抗過(guò)敏、降“三高”等重要功效[4-7]，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品、飼料、日化等領(lǐng)域。

由于牛樟芝生長(zhǎng)環(huán)境的特殊性，生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，野生資源枯竭，故其大規(guī)模的開(kāi)發(fā)應(yīng)用受到了極大的限制。目前，對(duì)于牛樟芝人工培育的研究多集中在利用正交試驗(yàn)或響應(yīng)面法優(yōu)化牛樟芝液體發(fā)酵條件[8]，及以樟芝胞外多糖和胞內(nèi)多糖為目的產(chǎn)物，探索樟芝液體發(fā)酵的培養(yǎng)基配方組成[9]。牛樟芝人工培育技術(shù)大致可以分為液體發(fā)酵法、固體培養(yǎng)法、椴木栽培法3 種[10]。通過(guò)液態(tài)發(fā)酵可以在短時(shí)間內(nèi)大量獲得牛樟芝菌絲體，是最有效的大規(guī)模人工培養(yǎng)方式，這種方法生產(chǎn)效率高、穩(wěn)定，也比較容易推廣。針對(duì)牛樟芝液態(tài)發(fā)酵的研究集中在提高菌體量、多糖產(chǎn)量方面，同時(shí)對(duì)多糖提取工藝、藥理活性等也有研究[11-13]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，菌株不同，其生物量、多糖和三萜的產(chǎn)量相差比較大，說(shuō)明菌株和培養(yǎng)條件對(duì)樟芝代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)量影響較大[14-15]。

本項(xiàng)目以牛樟芝為研究對(duì)象，采用篩選試驗(yàn)（Plackett-Burman，PB）[16]和中心組合設(shè)計(jì)（central composite design，CCD）試驗(yàn)[17]對(duì)其高產(chǎn)三萜類(lèi)化合物培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得生產(chǎn)三萜類(lèi)化合物的最佳培養(yǎng)基配方，為進(jìn)一步大規(guī)模的牛樟芝深層發(fā)酵培養(yǎng)提供指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

牛樟芝（Antrodia camphorata）信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院生物與制藥工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基（PDA 培養(yǎng)基）：200 g/L 馬鈴薯，20 g/L葡萄糖，15 g/L 瓊脂，pH 自然。

種子液培養(yǎng)基：200 g/L 馬鈴薯，20 g/L 葡萄糖，5 g/L蛋白胨，1 g/L MgSO4，2 g/L KH2PO4，50 mg/L VB1。

基本發(fā)酵培養(yǎng)基：20 g/L 葡萄糖，10 g/L 大豆粉，10 g/L 玉米粉，5 g/L 酵母粉，5 g/L 牛肉膏，10 g/L 黃豆粉，5 g/L 蛋白胨，1 g/L MgSO4，2 g/L KH2PO4，50 mg/L VB1。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)條件

采用二級(jí)發(fā)酵法獲得菌絲體[18]。將活化的斜面菌種接入種子液培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min 培養(yǎng)4 d 后，再以10%接種量接入裝有基本發(fā)酵培養(yǎng)基或優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶中，28 ℃、200 r/min 培養(yǎng) 10 d。用 6 層紗布減壓過(guò)濾收集菌絲體，用蒸餾水沖洗3 次，于55 ℃烘干至恒重。

1.2.2 三萜化合物含量測(cè)定

以齊墩果酸為標(biāo)準(zhǔn)物，用香草醛-高氯酸法在550 nm 波長(zhǎng)下繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。牛樟芝菌絲體中總?cè)苹衔锾崛『秃繙y(cè)定參照文獻(xiàn)[19]進(jìn)行。

1.2.3 PB 試驗(yàn)分析

選用 N=12 的 Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)考察基本發(fā)酵培養(yǎng)基的8 個(gè)組分對(duì)總?cè)坪康挠绊懀琍B試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素和水平如表1，其他3 個(gè)組分的濃度不變。設(shè)3 次重復(fù)試驗(yàn)，平行試驗(yàn)3 組，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用Design Expert 8.0.6（Stat-Ease Inc，Minneapolis，USA）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，篩選出對(duì)牛樟芝菌絲體產(chǎn)三萜影響顯著的主要因素。

表1 PB 試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels for Plackett-Burman（PB）design

1.2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

對(duì)PB 試驗(yàn)篩選出的主要因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，能最大限度逼近各因素的最大響應(yīng)區(qū)域。

1.2.5 響應(yīng)面分析法

根據(jù)CCD 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，使用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合，模型建立及方差分析。

1.2.6 擬合度試驗(yàn)

進(jìn)行擬合度試驗(yàn)，主要因素采用響應(yīng)面預(yù)測(cè)的最佳濃度，分析真實(shí)值和預(yù)測(cè)值之間的擬合度，驗(yàn)證所建回歸模型的適用性和可靠性。數(shù)據(jù)分析通過(guò)Excel 2010 處理，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析通過(guò)DPS 7.05 軟件處理，利用Design-expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PB試驗(yàn)結(jié)果及分析

PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，獲得的三萜含量為（6.86±0.17～13.54±0.34）mg/g。采用基本發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)的牛樟芝菌絲體中三萜含量為（12.29±0.43）mg/g。使用Design Expert 8.0.6 對(duì)表2 的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，其因素奉獻(xiàn)率及方差分析結(jié)果如表3。該模型P 值為0.015 4，達(dá)到顯著水平，說(shuō)明模型擬合良好。校正決定系數(shù)Radj2為0.933 9，說(shuō)明有93.39%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)的變異性可用該模型進(jìn)行解釋。

玉米粉（X3）和黃豆粉（X6）對(duì)三萜總含量的影響極顯著（P＜0.01），牛肉膏（X5）對(duì)三萜總含量的影響顯著（P＜0.05）。因此把 X3、X5、X63 個(gè)因素視為影響牛樟芝菌絲體三萜含量的主要因素。由表3 可知在顯著因素中，因素X3和X5的回歸系數(shù)為負(fù)數(shù)，說(shuō)明它們對(duì)三萜總含量的影響為負(fù)效應(yīng)，在最陡爬坡試驗(yàn)中應(yīng)降低其添加量，因素X6的系數(shù)為正值，后續(xù)應(yīng)提高其添加量。依據(jù)表3 貢獻(xiàn)率及相關(guān)系數(shù)的大小分析，后續(xù)試驗(yàn)不再添加次要因素酵母粉和蛋白胨，葡萄糖及大豆粉濃度分別確定為20、10 g/L。

表2 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design of PB test and corresponding results

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)玉米粉（X3）、牛肉膏（X5）和黃豆粉（X6）3 個(gè)顯著因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，X3、X5、X6的步長(zhǎng)分別為 6、1、5 g/L，步長(zhǎng)的計(jì)算方法參照[20]，具體試驗(yàn)編碼及結(jié)果如表4。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Steepest ascent design and results

由表4 可知，三萜化合物總含量在第4 組試驗(yàn)中達(dá)到最高，因此以該組對(duì)應(yīng)的玉米粉含量（18 g/L）、牛肉膏（4.5 g/L）和黃豆粉（30 g/L）作為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果及分析

2.3.1 中心組合設(shè)計(jì)及結(jié)果

采用CCD 試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)影響牛樟芝菌絲體產(chǎn)三萜化合物的3 個(gè)顯著因素：玉米粉含量（X3）、牛肉膏含量（X5）和黃豆粉含量（X6）進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，以產(chǎn)生的三萜含量（Y）為響應(yīng)值，選擇6 個(gè)中心點(diǎn)試驗(yàn)組以估計(jì)誤差，星號(hào)臂長(zhǎng)（γ）值為1.682，CCD試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Central composite design and results

2.3.2 回歸模型的建立及方差分析結(jié)果

應(yīng)用Design Expert 8.0.6 對(duì)表5 的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到二次多項(xiàng)回歸模型如下響應(yīng)面二項(xiàng)模型的方差分析見(jiàn)表6。

表6 響應(yīng)面二項(xiàng)模型的方差分析Table 6 ANOVA table for response surface quadratic model

續(xù)表6 響應(yīng)面二項(xiàng)模型的方差分析Continue table 6 ANOVA table for response surface quadratic model

由表6 的方差分析結(jié)果可知，回歸模型P＜0.000 1，達(dá)到極顯著水平；失擬項(xiàng)P=0.249 6，不顯著；決定系數(shù)R2=0.962 9，表明該模型擬合度良好；校正決定系數(shù)=0.929 6，表明大約有93%的響應(yīng)值（Y）變化可以用該模型進(jìn)行解釋。一次項(xiàng)X3、X6，二次項(xiàng)和對(duì)模型影響極顯著，交互項(xiàng)X3X6影響顯著，其余項(xiàng)影響不顯著。

2.3.3 響應(yīng)面分析與優(yōu)化

分別將玉米粉（X3）、牛肉膏（X5）和黃豆粉（X6）中的一個(gè)因子固定在中心點(diǎn)水平（0 水平），直觀(guān)分析另外兩個(gè)因素及其交互作用對(duì)響應(yīng)值影響效果的大小，其回歸模型的等高線(xiàn)及其響應(yīng)面如圖1～圖3 所示。

圖1 玉米粉和牛肉膏交互影響三萜含量的響應(yīng)面和等高線(xiàn)Fig.1 Response surface plots（left）and contour line（right）of effects of interactions between corn flour and beef extract on the triterpenoid content

圖2 玉米粉和黃豆粉交互影響三萜含量的響應(yīng)面和等高線(xiàn)Fig.2 Response surface plots（left）and contour line（right）of effects of interactions between corn flour and soybean meal on the triterpenoid content

圖3 牛肉膏和黃豆粉交互影響三萜含量的響應(yīng)面和等高線(xiàn)Fig.3 Response surface plots（left）and contour line（right）of effects of interactions between beef extract and soybean meal on the triterpenoid content

圖2 的等高線(xiàn)密集，呈橢圓形，說(shuō)明X3和X6的交互作用顯著。由圖1 和圖3 可知X3和X5及X5和X6的交互作用不顯著。

應(yīng)用Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)所建模型進(jìn)行參數(shù)優(yōu)化分析，玉米粉濃度為16.07 g/L，牛肉膏為4.5 g/L，黃豆粉為31.93 g/L，此時(shí)最大響應(yīng)值為15.46 mg/g。最終確定優(yōu)化后培養(yǎng)基配方為：20 g/L 葡萄糖，10 g/L 大豆粉，16.07 g/L 玉米粉，4.5 g/L 牛肉膏，31.93 g/L 黃豆粉，1 g/L MgSO4，2 g/L KH2PO4，50 mg/L VB1。

2.4 擬合度驗(yàn)證

用優(yōu)化的培養(yǎng)基配方進(jìn)行牛樟芝發(fā)酵培養(yǎng)，取3次重復(fù)試驗(yàn)的平均值，牛樟芝菌絲體三萜化合物含量為（15.40±0.15）mg/g，與模型預(yù)測(cè)值 15.46 mg/g 非常接近，與預(yù)測(cè)值擬合度良好，說(shuō)明上述模型能較好地預(yù)測(cè)菌絲體實(shí)際生產(chǎn)的三萜含量。

3 結(jié)論

本研究對(duì)牛樟芝菌絲體發(fā)酵產(chǎn)總?cè)祁?lèi)化合物的培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)PB 法篩選出玉米粉、牛肉膏、黃豆粉為影響總?cè)坪康? 個(gè)主要因素。根據(jù)CCD 中心組合試驗(yàn)及三因素三水平的響應(yīng)面分析，優(yōu)化得到菌絲體高產(chǎn)三萜的最佳培養(yǎng)基：20 g/L 葡萄糖，10 g/L 大豆粉，16.07 g/L 玉米粉，4.5 g/L 牛肉膏，31.93 g/L 黃豆粉，1 g/L MgSO4，2 g/L KH2PO4，50 mg/L VB1。采用基本發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)牛樟芝其菌絲體中總?cè)坪繛椋?2.29±0.43）mg/g，經(jīng)培養(yǎng)基優(yōu)化處理后三萜類(lèi)含量為（15.40±0.15）mg/g，相比初始其產(chǎn)量提高了25.3%。說(shuō)明響應(yīng)面法可用來(lái)優(yōu)化牛樟芝菌絲體高產(chǎn)三萜類(lèi)化合物的培養(yǎng)基配方，為進(jìn)一步大規(guī)模的牛樟芝深層發(fā)酵培養(yǎng)具有一定的參考價(jià)值。