柏夏瓊，陳介南，張林，詹鵬

（中南林業(yè)科技大學(xué)國(guó)家林業(yè)局生物乙醇研究中心，湖南省木本生物質(zhì)轉(zhuǎn)化工程技術(shù)研究中心，生物資源環(huán)境研究所，湖南長(zhǎng)沙410004）

西蘭花（Brassica oleracea L.var.italic Planch.），又名花椰菜、球花甘藍(lán)，一年生草本植物，是十字花科蕓薹屬綠色花球的變種[1]。原產(chǎn)于意大利，19 世紀(jì)末傳入中國(guó)。西蘭花營(yíng)養(yǎng)豐富且全面，主要包括蛋白質(zhì)、多糖、脂肪、礦物質(zhì)、維生素C 和胡蘿卜素等[2-3]。西蘭花還含有硫代葡萄糖苷的酶解產(chǎn)物或衍生物以及豐富的抗壞血酸和黃酮類化合物[4-6]。黃酮類化合物是植物體中重要的天然物質(zhì)，因其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)而具有抗炎癥、抗過(guò)敏、抗病毒、抗腫瘤、抗化學(xué)毒物、防治血管疾病及心腦血管疾病等功能[7-8]，在化妝品、功能食品及醫(yī)藥領(lǐng)域深受關(guān)注[9]。

在生產(chǎn)實(shí)踐中，發(fā)芽處理常被用作改善種子營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量的有效方法。利用現(xiàn)代生物技術(shù)控制種子萌發(fā)，不僅能轉(zhuǎn)化其中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還可以富集對(duì)人體有益的活性物質(zhì)，提高加工產(chǎn)品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能[10]。發(fā)芽過(guò)程中的營(yíng)養(yǎng)成分富集方法可分為兩類：生物誘導(dǎo)法與非生物誘導(dǎo)法。在現(xiàn)代食品加工中，利用非生物誘導(dǎo)富集功能性營(yíng)養(yǎng)成分的方法較多，而生物誘導(dǎo)法較少。非生物誘導(dǎo)法包括物理法、化學(xué)法和物理化學(xué)聯(lián)合法。一般物理法有外加電場(chǎng)、超聲波、輻射誘導(dǎo)、控制發(fā)芽過(guò)程中的濕度、種子浸泡時(shí)間等方法，化學(xué)法則是多采用不同的緩沖溶液、pH 值等手段實(shí)現(xiàn)富集[11]。白青云等[12]通過(guò)物理化學(xué)聯(lián)合法確定了發(fā)芽大豆富集多肽的最適培養(yǎng)條件：以pH 5.2 的檸檬酸緩沖（5 mmol/L）為培養(yǎng)液，在29 ℃時(shí)培養(yǎng)6 d 后，發(fā)芽大豆中多肽含量達(dá)到159.38 mg/g，是原料大豆中的3.83 倍。國(guó)內(nèi)外關(guān)于發(fā)芽谷物功能性成分富集的研究大多集中在大豆和糙米方面[13-16]，而對(duì)發(fā)芽西蘭花中功能性成分富集的研究報(bào)道仍為空白，且有文獻(xiàn)報(bào)道西蘭花無(wú)公害栽培技術(shù)，但未討論其最適消毒方法。本研究通過(guò)對(duì)西蘭花種子進(jìn)行消毒處理，篩選出適宜的消毒方法，并對(duì)西蘭花發(fā)芽過(guò)程總黃酮富集條件進(jìn)行優(yōu)化，獲得了較優(yōu)質(zhì)的西蘭花芽苗菜，以期為我國(guó)西蘭花苗菜產(chǎn)業(yè)的生產(chǎn)技術(shù)體系提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠霸王西蘭花：菏澤朔寧果蔬有限公司；蘆丁、Murashig-Skoog 培養(yǎng)基（murashig and skoog medium，MS）試劑（硝酸銨、硝酸鉀、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀、二水氯化鈣、碘化鉀、硼酸、四水硫酸錳、七水硫酸鋅、四水鉬酸鈉、五水硫酸銅、六水氯化鈷、乙二胺四乙酸二鈉、七水硫酸亞鐵、甘氨酸、肌醇、鹽酸硫胺素、煙酸、鹽酸吡哆醇）、2，4-二氯苯氧乙酸、激動(dòng)素KT、萘乙酸、6-芐基氨基腺嘌、氫氧化鈉、濃鹽酸、無(wú)水乙醇、瓊脂、蔗糖、硝酸鈉、硝酸鋁：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2450 型紫外分光光度計(jì)：島津企業(yè)管理有限公司；CJ-ID 潔凈工作臺(tái)、250 數(shù)顯光照培養(yǎng)箱：天津市泰斯特儀器有限公司；FD-1C 冷凍干燥機(jī)：北京市德天佑科技發(fā)展有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 種子消毒方法篩選

1.3.1.1 不同物理消毒方法處理西蘭花種子

采用清水漂浮法對(duì)西蘭花進(jìn)行選種，棄漂浮的豆種，選取底部顆粒飽滿、大小一致的種子待試驗(yàn)用。采用不同物理方法處理西蘭花，每個(gè)處理隨機(jī)選取100粒種子，操作方法[17-19]如下：

1）空白對(duì)照（control check，CK）：種子不作任何處理，直接催芽；2）溫湯浸種法：種子用 50 ℃～55 ℃熱水浸種10 min；3）干熱處理法：種子在70 ℃的恒溫箱中處理48 h；4）紫外殺菌法：利用無(wú)菌操作臺(tái)單人超凈工作臺(tái)紫外燈分別照射10、20、30 min。

1.3.1.2 種子處理后在培養(yǎng)箱中的管理

將處理后的種子用無(wú)菌水浸泡6 h，均勻地平鋪在墊有3 層濕潤(rùn)育苗紙的育苗盤內(nèi)，上蓋1 層濕潤(rùn)育苗紙作為保濕材料，于24 ℃光照培養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)，每天噴水2 次～3 次，以盤內(nèi)不積且不滴水為宜。以種子胚部破裂為萌動(dòng)，以胚根突破種皮的下胚軸長(zhǎng)超過(guò)種子自身的長(zhǎng)視為發(fā)芽[17]。

1.3.1.3 消毒效果檢測(cè)

將處理后的種子接種于MS 培養(yǎng)基，置于24 ℃光照培養(yǎng)箱中，避光培養(yǎng)，并每天觀察種子上是否有雜菌長(zhǎng)出，若有則記下污染數(shù)[18]。

1.3.1.4 二次消毒處理

試驗(yàn)結(jié)果顯示物理消毒殺菌不完全，需食品級(jí)消毒劑奧克泰士D10 進(jìn)行二次消毒。將奧克泰士D10 分別稀釋為0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的種子消毒浸泡液，備用。將1.3.1.1 中最優(yōu)物理消毒處理后的種子用不同濃度的奧克泰士 D10 分別浸泡 2、4、6、8、10、12、14 h，以無(wú)菌水為對(duì)照。通過(guò)對(duì)比發(fā)芽率及污染率確定最適濃度和最低耗時(shí)。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

1.3.2.1 浸泡溫度對(duì)總黃酮含量的影響

將物理消毒處理的種子用20 倍1%奧克泰士D10浸泡，在浸泡溫度分別為 20、25、30、35、40 ℃浸泡 6 h，發(fā)芽溫度24 ℃的條件下發(fā)芽5 d，測(cè)定總黃酮含量。

1.3.2.2 浸泡時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

將物理消毒處理的種子用20 倍1%食品級(jí)奧克泰士 D10，在浸泡溫度 30 ℃分別水浴 6、8、10、12、14 h，發(fā)芽溫度24 ℃的條件下發(fā)芽5 d，測(cè)定總黃酮含量。

1.3.2.3 發(fā)芽溫度對(duì)總黃酮含量的影響

將物理消毒處理的種子用20 倍1 %奧克泰士D10 浸泡，在浸泡溫度30 ℃，浸泡時(shí)間6 h，發(fā)芽溫度分別為 16、20、24、28、32 ℃的條件下發(fā)芽 5 d，測(cè)定總黃酮含量。

1.3.2.4 發(fā)芽時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

將物理消毒處理的種子用20 倍1 %奧克泰士D10 浸泡，在浸泡溫度30 ℃，浸泡時(shí)間6 h，發(fā)芽溫度24 ℃的條件下分別發(fā)芽 1、2、3、4、5 d，測(cè)定總黃酮含量。

1.3.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選用浸泡溫度（A）、發(fā)芽溫度（B）、發(fā)芽時(shí)間（C）3 個(gè)因素，每個(gè)因素選擇 3 個(gè)水平，采用L9（33）正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選，以期獲得高含量總黃酮的西蘭花芽苗。正交試驗(yàn)未選用浸泡時(shí)間的原因是西蘭花種子體積小，萌發(fā)所需水分可在短時(shí)間內(nèi)達(dá)到飽和，且試驗(yàn)浸泡時(shí)間范圍內(nèi)指標(biāo)值變化不大。正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 L9（33）正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 The level of L9（33）orthogonal experiment factors

1.3.4 總黃酮含量測(cè)定

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行紫外圖譜掃描，確定出最大吸收波長(zhǎng)，并在此波長(zhǎng)下采NaNO2-Al（NO3）3比色法[20]測(cè)定不同質(zhì)量濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度，繪制出蘆丁質(zhì)量濃度C 與吸光度A 關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A=0.014 91C-0.002 91（R2=0.999 8）。

1.3.4.2 西蘭花總黃酮的測(cè)定

樣品處理：-20 ℃預(yù)冷凍2 h，真空冷凍干燥48 h，粉碎，過(guò) 40 目篩，密封保存[21-23]。

含量測(cè)定：取一定量冷凍粉碎樣品于50 mL 三角瓶中，加入 60%乙醇溶液，料液比 1 ∶30（g/mL），加稀堿調(diào)至pH 8，80 ℃水浴振蕩1.5 h，冷卻，10 000 r/min離心10 min 后收集上清液。精密量取1 mL 上清液分別置于25 mL 容量瓶中，加入5%NaNO2溶液0.3 mL 靜置10 min 后，加10%Al（NO3）3溶液0.3 mL 靜置10 min，再加入1 mol/L NaOH 溶液4 mL，分別用30%乙醇定容至25 mL，搖勻，放置15 min，在510 nm 處測(cè)定吸光度值[24-27]。并代入回歸方程計(jì)算總黃酮的含量，試驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.5 西蘭花不同生長(zhǎng)情況下總黃酮含量測(cè)定

準(zhǔn)確稱量相同質(zhì)量的自然生長(zhǎng)的芽苗、最適發(fā)芽條件生長(zhǎng)的芽苗和成熟西蘭花花球，根據(jù)1.3.4 的步驟分別測(cè)定總黃酮含量。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

利用Origin7.5 對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及相關(guān)分析，所有的試驗(yàn)平行3 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子消毒結(jié)果分析

2.1.1 不同物理消毒對(duì)西蘭花種子發(fā)芽時(shí)間的影響不同消毒方法對(duì)種子發(fā)芽時(shí)間的影響見圖1。

圖1 不同消毒方法對(duì)種子發(fā)芽時(shí)間的影響Fig.1 Effect of different sterilizing methods on seed germination time

從圖1 可以看出，物理消毒方法與對(duì)照組均在處理后的第2 天達(dá)到發(fā)芽高峰期，且CK、溫湯處理、干熱處理、紫外處理10 min、紫外處理20 min、紫外處理30 min 的發(fā)芽數(shù)分別為 55、59、40、65、57、53。故紫外處理10 min＞溫湯處理＞紫外處理20 min＞CK＞紫外處理30 min＞干熱處理。

2.1.2 不同物理方法處理對(duì)西蘭花的影響

不同消毒處理對(duì)西蘭花發(fā)芽率、污染率的影響見表2。

表2 不同消毒處理對(duì)西蘭花發(fā)芽率、污染率的影響（7 d）Table 2 Effect of different sterilizing methods on germination rate and contamination rate of broccoli（7 d）

由表2 可知，除紫外消毒處理10 min 外，其他處理均會(huì)使得西蘭花發(fā)芽率降低，且干熱處理發(fā)芽率最低；而發(fā)芽7 d 內(nèi)的消毒效果：紫外消毒處理30 min 最優(yōu)，紫外消毒處理20 min 次之，干熱處理最差。綜合發(fā)芽率、污染率兩者來(lái)看，污染率對(duì)發(fā)芽率的影響較小，可能原因是西蘭花在萌發(fā)第2 天達(dá)到發(fā)芽高峰期而此時(shí)微生物少且生長(zhǎng)速率慢。故適宜的物理消毒處理應(yīng)選紫外消毒處理10 min。

2.1.3 二次消毒對(duì)西蘭花的影響

消毒劑不同使用情況下西蘭花發(fā)芽率及污染率的變化見圖2。

圖2 消毒劑不同使用情況下西蘭花發(fā)芽率及污染率的變化Fig.2 Changes of germination rate and contamination rate content of broccoli under different use of disinfectant

由圖2 可知，與對(duì)照組相比，消毒劑的使用降低了污染率同時(shí)也抑制種子萌發(fā)。隨著消毒劑濃度的增大，西蘭花發(fā)芽率呈下降趨勢(shì)，原因可能是該消毒劑超過(guò)一定濃度具有漂白作用，影響了種子萌發(fā)；而相同濃度消毒劑使用時(shí)間對(duì)發(fā)芽率影響不顯著。原因可能是在使用一段時(shí)間后，消毒劑有效成分過(guò)氧化氫基本消耗。消毒劑濃度增大，使得污染率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而降低；濃度為0.5%時(shí)，1%～3%范圍內(nèi)，浸泡6 h 可消毒完全，4%～5%時(shí)則只需4 h。在消毒不完全的情況下，雜菌污染并不能影響西蘭花發(fā)芽率，可能原因是發(fā)芽前期微生物繁殖速度慢，不能抑制西蘭花萌發(fā)，但后期大量的微生物會(huì)致使幼苗發(fā)病，造成弱苗、死苗的現(xiàn)象。綜合發(fā)芽率、污染率兩者考慮，最適的消毒處理為紫外消毒處理10 min 聯(lián)合1%食品級(jí)奧克泰士消毒劑處理6 h。

2.2 富集總黃酮西蘭花發(fā)芽條件優(yōu)化結(jié)果分析

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1.1 浸泡溫度對(duì)總黃酮含量的影響

浸泡溫度對(duì)發(fā)芽西蘭花總黃酮含量的影響見圖3。

圖3 浸泡溫度對(duì)發(fā)芽西蘭花總黃酮含量的影響Fig.3 Individual effect of soaking temperature on total flavonoids content in germinated broccoli

如圖3 所示，隨著浸泡溫度的升高，總黃酮含量先升高后降低，浸泡溫度為30 ℃時(shí)達(dá)到最大值10.09 mg/g；在浸泡溫度30 ℃～40 ℃條件下，總黃酮含量略有下降。原因可能是在一定溫度范圍內(nèi)，溫度越高，西蘭花中的酶系更易被激活，促進(jìn)黃酮類化合物的合成，而超過(guò)這個(gè)溫度范圍則抑制酶系活力使總黃酮含量降低。因此，確定最佳浸泡溫度為30 ℃。

2.2.1.2 浸泡時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

浸泡時(shí)間對(duì)發(fā)芽西蘭花總黃酮含量的影響見圖4。

圖4 浸泡時(shí)間對(duì)發(fā)芽西蘭花總黃酮含量的影響Fig.4 Individual effect of soaking time on total flavonoids content in germinated broccoli

由圖4 可知，在浸泡時(shí)間6 h～10 h 范圍內(nèi)，總黃酮含量先下降后升高，10 h 時(shí)總黃酮含量達(dá)到最大值10.71 mg/g。此后總黃酮含量略有下降。然而整個(gè)浸泡時(shí)間段的總黃酮含量變化區(qū)間在0.1 mg/g 以內(nèi)，原因可能是西蘭花種子個(gè)體小，萌芽所需水分少，短時(shí)間浸泡即可達(dá)到飽和，短時(shí)間內(nèi)破壞細(xì)胞壁，釋放結(jié)合性黃酮類化合物，使其含量達(dá)到一定值?？紤]時(shí)間消耗和消毒劑最低有效時(shí)間6 h，故確定最佳浸泡時(shí)間為6 h 且該因素不做正交試驗(yàn)。

2.2.1.3 發(fā)芽溫度對(duì)總黃酮含量的影響

發(fā)芽溫度對(duì)發(fā)芽西蘭花總黃酮含量的影響見圖5。

圖5 發(fā)芽溫度對(duì)發(fā)芽西蘭花總黃酮含量的影響Fig.5 Individual effect of germinal temperature on total flavonoids content in germinated broccoli

由圖 5 可知，在發(fā)芽溫度 16 ℃～24 ℃范圍內(nèi)，總黃酮含量隨發(fā)芽溫度的升高而略微增加，發(fā)芽溫度為24 ℃時(shí)達(dá)到最大值 10.62 mg/g；但是在 24 ℃～32 ℃范圍內(nèi)，總黃酮含量迅速下降。原因可能是：1）在25 ℃浸泡后，降至16 ℃培養(yǎng)，較大的溫差致使植物細(xì)胞區(qū)室化增強(qiáng)，從而使莽草酸途徑和多酮化途徑中的關(guān)鍵酶活性變大，引起總黃酮含量增加；2）隨著溫度升高，細(xì)胞內(nèi)酶活性提高，加快了某些反應(yīng)的進(jìn)行，促進(jìn)了總黃酮的積累，但當(dāng)總黃酮含量積累到一定量時(shí)，被降解使含量降低。因此，確定最佳發(fā)芽溫度為24 ℃。

2.2.1.4 發(fā)芽時(shí)間對(duì)總黃酮含量的影響

發(fā)芽時(shí)間對(duì)發(fā)芽西蘭花總黃酮含量的影響見圖6。

圖6 發(fā)芽時(shí)間對(duì)發(fā)芽西蘭花總黃酮含量的影響Fig.6 Individual effect of germinal time on total flavonoids content in germinated broccoli

由圖6 可知，第1 天～第4 天，總黃酮含量隨發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速增加，原因可能是在發(fā)芽初期，碳水化合物和蛋白質(zhì)被降解，單糖和游離氨基酸增加，使得黃酮類化合物生物合成增加；第4 天～第5 天總黃酮含量增加量為0.02 mg/g，其含量為10.64 mg/g，原因可能是隨著時(shí)間延長(zhǎng)，黃酮類化合物增加到一定量后會(huì)被降解，降解后又合成，最終維持適當(dāng)含量?？紤]發(fā)芽時(shí)間，因此，選擇最佳發(fā)芽時(shí)間為4 d。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

正交試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of the orthogonal experiment

根據(jù)表3 正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)可知，西蘭花發(fā)芽富集總黃酮的最優(yōu)條件為：浸泡溫度25 ℃、浸泡時(shí)間6 h、發(fā)芽溫度20 ℃、發(fā)芽時(shí)間4 d。由極差分析結(jié)果可知，影響程度：發(fā)芽溫度＞浸泡溫度＞發(fā)芽時(shí)間。按最佳試驗(yàn)條件進(jìn)行了3 次驗(yàn)證試驗(yàn)，得西蘭花芽苗總黃酮含量平均為11.33 mg/g。

2.3 各生長(zhǎng)情況下西蘭花總黃酮的比較

不同生長(zhǎng)情況下西蘭花總黃酮含量的比較見表4。

表4 不同生長(zhǎng)情況下西蘭花總黃酮含量的比較Table 4 Comparison of total flavonoids content in broccoli under different growth conditions

由表4 可知，優(yōu)化條件下生長(zhǎng)的芽苗總黃酮含量最高，是自然環(huán)境生長(zhǎng)的西蘭花芽苗的1.47 倍，是成熟西蘭花花球的4.43 倍。

3 結(jié)論

試驗(yàn)對(duì)西蘭花進(jìn)行了多種消毒處理，發(fā)現(xiàn)采用紫外消毒10 min 聯(lián)合1%食品級(jí)奧克泰士D10 消毒效果好，且能提高發(fā)芽率。

通過(guò)考察多種因素對(duì)西蘭花芽苗中總黃酮含量的影響，利用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)及驗(yàn)證性試驗(yàn)得到了浸泡溫度、發(fā)芽溫度、發(fā)芽時(shí)間均對(duì)西蘭花芽苗中總黃酮含量均有一定影響，確定的最佳發(fā)芽條件為：浸泡溫度25 ℃、浸泡時(shí)間6 h、發(fā)芽溫度20 ℃、發(fā)芽時(shí)間4 d。此條件下西蘭花總黃酮為11.33 mg/g，其總黃酮含量是自然環(huán)境生長(zhǎng)的西蘭花芽苗的1.47 倍，是成熟西蘭花花球的4.43 倍。