秦紹釗 鄧潔 王建偉

摘 要：對(duì)貴州油茶主要種植區(qū)采集到的油茶葉斑病葉片，采用形態(tài)學(xué)鑒定及多基因分子鑒定的方法，對(duì)分離的葉枯病病原菌進(jìn)行系統(tǒng)鑒定。結(jié)果表明：在編碼轉(zhuǎn)錄延伸因子（TEF）、微管蛋白基因（TUB2）2基因所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，KLXYL-3-2菌分別與葡萄座腔菌屬KP642037.1、KX464911.1和MG000590.1菌株聚為一個(gè)獨(dú)立的進(jìn)化分支且置信度為99%，結(jié)合其形態(tài)特征，將其鑒定為可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）。

關(guān)鍵詞：油茶;可可毛色二孢菌;葉枯病;形態(tài)學(xué);分子鑒定

文章編號(hào)：1004-7026（2020）01-0090-02? ? ? ? ?中國(guó)圖書分類號(hào)：S435.711? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

油茶是貴州省農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)革命的特色產(chǎn)業(yè)之一，截至2019年9月，貴州油茶現(xiàn)有26個(gè)品牌。隨著油茶基地規(guī)模逐漸擴(kuò)大、低產(chǎn)林改造和油茶精深加工水平提升，油茶產(chǎn)業(yè)的重要性日漸凸顯，病害防控工作的重要性得以體現(xiàn)。油茶葉斑病發(fā)病癥狀包括枝枯、根腐、枯萎、葉斑及叢枝等。劉小玉等（2019）[1]報(bào)道海南油茶葉斑病的病原為可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）。任亞峰等（2019）[2]報(bào)道在貴州茶樹(shù)葉斑病的病原為可可毛色二孢（L.theobromae）。目前，貴州未見(jiàn)由可可毛色二孢菌引起的油茶葉斑病的相關(guān)報(bào)道。

可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）屬葡萄座腔菌屬（Botryosphaeria）病原菌的無(wú)性型[3]。葡萄座腔菌的一些種是弱勢(shì)致病菌，它們一般不會(huì)直接侵染寄主植物，但作為葉枯病致病菌的可可毛色二孢菌廣泛分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，寄主十分廣泛。本試驗(yàn)通過(guò)病葉組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離、培養(yǎng)，并對(duì)其開(kāi)展形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)研究，旨在明確病原菌種類，為探明其發(fā)生傳播規(guī)律及防治奠定研究基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

2015—2018年采集油茶葉斑病葉片標(biāo)本于黔東南州凱里市、錦屏縣及黃平縣，以及銅仁市石阡縣、江口縣及思南縣，分別集中于6—7月、10—11月采集病樣，典型病征（圖1）。發(fā)病初期葉緣變色，向內(nèi)葉蔓延;發(fā)病后期病斑淡褐色，病部和健康部分界線明顯，病斑凹陷，逐漸擴(kuò)大成不規(guī)則病斑。

1.2? 方法

1.2.1? 病原菌的分離純化

常規(guī)組織分離法：先用75%的酒精處理病健交界的組織，0.1%升汞溶液消毒，無(wú)菌水漂洗干凈，PDA培養(yǎng)基純化培養(yǎng)，置于4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 病原菌的形態(tài)鑒定

取5 mm菌餅，在PDA平板28 ℃光照16 h培養(yǎng)，2～5 d連續(xù)觀察菌落的形態(tài)、顏色。取10 μL分生孢子懸浮液，在光學(xué)顯微鏡下觀察記錄其大小及形態(tài)特征。

1.2.3? 分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析

取20 mg菌絲經(jīng)液氮研磨，樣品DNA提取用生工生物工程（上海）股份有限公司的試劑盒，Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒SK8259。擴(kuò)增引物如下：Bt2a5GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC3，Bt2b5ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC3;EF1F5GTCGTYGTYATYGGHCAYGT3，EF1R5ACHGTRCCRATACCACCRATCTT3。

將測(cè)序rDNA-TEF和rDNA-TUB2序列與GenBank中相關(guān)序列分別用ClustalX1.83軟件進(jìn)行比對(duì)分析。選出與各分離菌株相似度較高的相應(yīng)序列，采用MEGA7.0.14軟件中的最大簡(jiǎn)約法（MP）做聚類分析，把所有堿基狀態(tài)處理為無(wú)序，并給以相同權(quán)重。自舉檢驗(yàn)重復(fù)1 000次以獲得各分支的支持率，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 病原菌菌落與形態(tài)特征

采用常規(guī)組織塊法分離得到菌株編號(hào)為KLXYL-3-2。菌株KLXYL-3-2在PDA培養(yǎng)基平板形成圓形或近圓形菌落。菌落正面呈棉絮狀，初生菌絲灰白色，邊緣蓬松，氣生菌絲生長(zhǎng)旺盛，菌落后期轉(zhuǎn)墨綠色或淺黑色，36～48 h菌絲即可布滿整個(gè)PDA平板（圖2A）。菌落反面可見(jiàn)灰黑色，甚至黑色（圖2B）。子座呈圓球狀或棍棒狀，大小為（1.8～9.2）？滋m×（1.9～3.8） mm。子座內(nèi)有多個(gè)分生抱子器。

分生孢子為單孢，呈卵圓形或橢圓形，大小約為（12.5～16.2） ？滋m×（19.5～28.8） ？滋m，早期無(wú)色似透明（圖3）。

這些形態(tài)特征與劉小玉等人描述可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）形態(tài)特征基本一致。因此，初步確認(rèn)菌株KLXYL-3-2為可可毛色二孢菌。

2.2? 分子鑒定

以葉斑病病原菌6個(gè)菌株的DNA為模板，對(duì)編碼轉(zhuǎn)錄延伸因子（TEF）、微管蛋白基因（TUB2）進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序。分別與GenBank中同屬菌株序列進(jìn)行同源性比較，確定6個(gè)菌株同屬于可可毛色二孢菌（L.theobromae），與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

代表菌株KLXYL-3-2的TEF和TUB2基因與其他同屬菌株的序列經(jīng)最大簡(jiǎn)約法（MP）共同構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中，分別與可可毛色二孢菌（L.theobromae）菌株（KP642037.1、KX464911.1和MG000590.1）同源性高達(dá)99%～100%，進(jìn)化分析聚在同一分支上，能與同屬其他菌株明顯區(qū)分開(kāi)。因此，根據(jù)分離病原物的形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合單基因（TEF-TUB2）系統(tǒng)發(fā)育學(xué)鑒定結(jié)果，將KLXYL-3-2鑒定為可可毛色二孢菌（Lasiodiplodia theobromae）。

3? 結(jié)論與討論

本研究所鑒定的油茶可可毛色二孢菌（L.theobromae），在貴州油茶葉枯病的相關(guān)研究屬于首次報(bào)道。田間調(diào)查期間發(fā)現(xiàn)，可可毛色二孢菌在油茶樹(shù)葉片、嫩莖上發(fā)病迅速，病斑擴(kuò)展速度快，染病后期葉片枯萎、脫落，今后可能會(huì)上升為貴州油茶產(chǎn)區(qū)的主要病害。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉小玉，余鳳玉，付登強(qiáng)，等.油茶葉斑病菌的分離、鑒定及生物學(xué)特性研究[J].中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)，2019（86）：38-42.

[2]任亞峰，包興濤，李冬雪，等.茶樹(shù)葉斑病病原菌可可毛色二孢菌的鑒定[J/OL].http：//kns.cnki.net/KCMS/detail/11.2184.Q.20190304.1052.001.html.

[3]Punithalingam E.Plant diseases attributed to Botryodiplodia theobromae Pat [J]. Bibliotheca Mycologia，1980（71）：1-123.