李雙良 陶 艷

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上第五大常見癌癥和癌癥死亡的第三大原因，占原發(fā)性肝癌的90%以上[1]。HCC的主要原因是持續(xù)的乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染，其發(fā)生在一半以上的HCC中[2]。代表大多數(shù)人類基因組轉(zhuǎn)錄物的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)最初被認為是“垃圾RNA”，因為它們不能編碼蛋白質(zhì)[3]。但是越來越多的證據(jù)表明，lncRNAs在各種生物過程中也發(fā)揮著重要作用，包括細胞增殖，侵襲和轉(zhuǎn)移，自噬和細胞凋亡，從而促進不同人類癌癥的發(fā)展，包括HCC[4]。最近，據(jù)報道，幾種lncRNA在HBV相關(guān)的HCC組織和血清中經(jīng)常失調(diào)，包括HOX轉(zhuǎn)錄物反義基因間RNA(HOX transcript antisense intergenic RNA,HOTAIR)、印跡母系表達的非翻譯mRNA(imprinted maternally expressed untranslated mRNA,H19)、肝癌高度上調(diào)因子(highly upregulated in liver cancer,HULC)，然而，其在HCC診斷中的意義尚未明確[5-8]?；诖?，本研究旨在探討長鏈非編碼RNA HOTAIR,H19,HULC聯(lián)合檢測對HBV相關(guān)肝癌的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

納入2017年1月至2019年1月我院收治的早期HBV相關(guān)肝癌患者120例為腫瘤組，其中男性68例、女性52例，年齡37～71歲，平均年齡(47.28±15.92)歲；腫瘤直徑1.2～2.5 cm，平均直徑為(1.64±0.59)cm； TNM分期：Ⅰ期89例，Ⅱ期31例。120例早期HBV相關(guān)肝癌患者均經(jīng)我院病理科證實。排除標準：①嚴重心、肝、腎功能損害者；②長期使用皮質(zhì)類固醇激素及免疫抑制劑者；③患有精神疾病者；④患有其他癌癥者；⑤血清中HCV陽性者；⑥血清中HBV陰性者。同時，納入2017年1月至2019年1月至我院體檢的健康體檢者120例為對照組，其中男性62例、女性58例，年齡41～72歲，平均年齡(48.20±17.29)歲。2組一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，可納入此次分析。受試者均簽署知情同意書。

1.2 實時熒光定量PCR

采取120例HBV相關(guān)肝癌患者和120例健康體檢者的清晨肘前靜脈血6 ml。所有實驗在取樣后2 h內(nèi)開始。長鏈非編碼RNA HOTAIR,H19,HULC,GAPDH的引物均交由上海生工合成，序列見表1。使用內(nèi)參GAPDH的表達量標準化HOTAIR,H19,HULC的表達量。RNA快速提取試劑盒購自南京賽泓瑞生物科技有限公司(貨號：RN0302)。反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自上海千曦生物科技有限公司(貨號：k1622)。RT-PCR 兩步法試劑盒購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司(貨號：BK2100)。根據(jù)試劑盒的說明書進行實時熒光定量PCR反應(yīng)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

RISM 7.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析，方差齊者采用 LSD 法比較，方差不齊者采用Tamhane′T2法比較。應(yīng)用受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)分析長鏈非編碼RNA HOTAIR、H19、HULC檢測HBV相關(guān)肝癌的臨床診斷價值。陽性臨界值為ROC曲線中靈敏度-(1-特異度)的最大值所對應(yīng)的數(shù)值。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBV相關(guān)肝癌患者和健康體檢者血清中長鏈非編碼RNA HOTAIR、H19、HULC的表達量

HBV相關(guān)肝癌患者血清中長鏈非編碼RNA HOTAIR、H19、HULC的表達量均高于健康體檢者(P<0.05)，見表2。

表2 2組受試者血清中長鏈非編碼RNA HOTAIR,H19,HULC的表達量比較

2.2 HBV相關(guān)肝癌患者和健康體檢者長鏈非編碼RNA HOTAIR,H19,HULC的ROC曲線、AUC、靈敏度、特異度和截斷值

為了評估長鏈非編碼RNA HOTAIR,H19,HULC在HBV相關(guān)肝癌患者與健康體檢者中的診斷價值，繪制120例HBV相關(guān)肝癌患者和120例健康體檢者的ROC曲線(圖1)。HOTAIR的受試者工作特征曲線的AUC為(0.83±0.03)(95%CI 0.7734～0.8884)，以HOTAIR的陽性臨界值為1.936，其診斷靈敏度為86%，特異度為85%；H19的受試者工作特征曲線的AUC為(0.87±0.03)(95%CI 0.8244～0.9248)，以H19的陽性臨界值為0.8573，其診斷靈敏度為89%，特異度為90%；HULC的受試者工作特征曲線的AUC為(0.92±0.02)(95%CI 0.8878～0.9636)，以HULC的陽性臨界值為1.593，其診斷靈敏度為91%，特異度為93%。見圖1和表3。

2.3 長鏈非編碼RNA HOTAIR,H19,HULC聯(lián)合診斷HBV相關(guān)肝癌

患有HBV相關(guān)肝癌的為真陽性，未患有HBV相關(guān)肝癌的為真陰性。以HOTAIR的陽性臨界值為1.936，H19的陽性臨界值為0.8573，HULC的陽性臨界值為1.593為診斷標準，三者均滿足為聯(lián)合診斷陽性，反之則為聯(lián)合診斷陰性。長鏈非編碼RNA HOTAIR,H19,HULC聯(lián)合對HBV相關(guān)肝癌的診斷的的靈敏度為91.67%(110/120)，特異度為93.33%(112/120)，準確度為92.50%(222/240)，見表4。

表3 HBV相關(guān)肝癌患者和健康體檢者長鏈非編碼RNA HOTAIR,H19,HULC的AUC、靈敏度、特異度和截斷值

表4 長鏈非編碼RNA HOTAIR,H19,HULC聯(lián)合診斷HBV相關(guān)肝癌/例

圖1 HBV相關(guān)肝癌患者和健康體檢者長鏈非編碼RNA HOTAIR,H19,HULC的ROC曲線

3 討論

HCC是全球第三大癌癥相關(guān)死亡原因，是五種最常見的癌癥之一[9]。在亞洲高度流行的亞太地區(qū)，特別是中國，HBV感染與70%～90%的HCC患者有關(guān)[10-12]。因此，盡早對HBV相關(guān)HCC進行診斷迫在眉睫。在本研究中，通過酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測研究組和對照組血清中長鏈非編碼RNA HOTAIR,H19,HULC的表達量并評價其聯(lián)合診斷HBV相關(guān)肝癌的價值，發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA HOTAIR,H19,HULC聯(lián)合鑒別早期HBV相關(guān)肝癌的診斷的靈敏度為91.67%，特異度為93.33%，準確度為92.50%。

HBV對HOTAIR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控與2種轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物的調(diào)節(jié)有關(guān)：PRC2和LSD1/Co-REST/HDAC1，它們通過與HOTAIR結(jié)合在一起[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)HBV相關(guān)肝癌患者血清中長鏈非編碼RNA HOTAIR的表達量均高于健康體檢者(P<0.05)。在HBV復(fù)制細胞中，發(fā)現(xiàn)Plk1被HBV的HBx蛋白激活，并且Plk1的激活誘導(dǎo)SUZ12(PRC2復(fù)合物的必需亞基)和ZNF198的蛋白酶體降解，促使LSD1/Co-REST/HDAC1復(fù)合物不穩(wěn)定，導(dǎo)致染色質(zhì)修飾并導(dǎo)致HOTAIR轉(zhuǎn)錄的激活。長鏈非編碼RNA HOTAIR在鑒別早期HBV相關(guān)肝癌患者與健康人群的靈敏度和特異度分別為86%和85%，提示長鏈非編碼RNA HOTAIR是一種潛在的HBV相關(guān)肝癌的腫瘤標志物。

HBV對另一種lncRNA HULC的轉(zhuǎn)錄調(diào)控是由CREB介導(dǎo)的[15]。本研究發(fā)現(xiàn)HBV相關(guān)肝癌患者血清中長鏈非編碼RNA H19的表達量均高于健康體檢者(P<0.05)。據(jù)報道CREB將P300和Brg募集到HULC啟動子中，導(dǎo)致表觀遺傳標記和染色質(zhì)重塑的激活并導(dǎo)致HULC的轉(zhuǎn)錄。通過與CREB相互作用，HBx激活HULC啟動子活性，從而增加HULC轉(zhuǎn)錄。長鏈非編碼RNA HULC在鑒別早期HBV相關(guān)肝癌患者與健康人群的靈敏度和特異度分別為89%和90%。因此，長鏈非編碼RNA HULC可作為臨床上診斷HBV相關(guān)肝癌的潛在標志。

已經(jīng)發(fā)現(xiàn)HBV相關(guān)HCC中的H19通過調(diào)節(jié)EMT相關(guān)基因，多種的信號傳導(dǎo)途徑和腫瘤微環(huán)境來調(diào)節(jié)HCC細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[16-20]。本研究發(fā)現(xiàn)HBV相關(guān)肝癌患者血清中長鏈非編碼RNA HULC的表達量均高于健康體檢者(P<0.05)。H19通過促進表觀遺傳調(diào)節(jié)增加miR-200家族的表達來抑制EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子ZEB1/2的表達，而HBx-LINE1消耗miR-122，促進EMT樣變化，包括Wnt/β-catenin信號激活，E-鈣粘蛋白受到抑制，細胞遷移增強，從而促進HCC細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。長鏈非編碼RNA H19在鑒別早期HBV相關(guān)肝癌患者與健康人群的靈敏度和特異度分別為91%和93%，顯示了較好的診斷效能。

綜上所述，長鏈非編碼RNA HOTAIR,H19,HULC的表達量可作為診斷早期HBV相關(guān)肝癌的潛在標志。