張紅麗，黃 靖，劉 霞，吳赟竑，馮肖肖，吳雪軍，徐 輝

(浙江省動物疫病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 311199)

鴨瘟，又稱鴨病毒性腸炎，是由鴨瘟病毒引起的一種急性、高度接觸性傳染病，發(fā)病率和死亡率可達100%。鴨瘟病毒(duck enteritis virus，DEV)屬于皰疹病毒目皰疹病毒科皰疹病毒甲亞科，可感染48種以上的雁形目水禽[1-2]。

鴨瘟病毒基因組為雙股線狀DNA，包括長獨特區(qū)(unique long，UL)、短獨特區(qū)(unique short，US)，以及內(nèi)部和末端的反向重復(fù)序列，結(jié)構(gòu)為UL-IRS-US-TRS[3]。鴨瘟病毒基因組全長約為160 kb，含有78個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，包含潛在的76個能編碼功能蛋白的ORF。功能性蛋白主要分為結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白。囊膜蛋白是主要的結(jié)構(gòu)蛋白，包括糖蛋白gK、gM、gN、gH、gB、gC、gL、gG、gJ、gD、gI、gE。除gC蛋白外，其他蛋白均為病毒囊膜的主要成分。糖蛋白具有吸附、傳入敏感細胞、融合細胞并進行細胞間傳播，同時攜帶抗原決定簇，可誘導(dǎo)機體免疫應(yīng)答反應(yīng)，造成機體組織的病理損傷。gB蛋白含有鴨瘟病毒的主要抗原位點，是淋巴細胞增生性應(yīng)答的靶點，參與細胞免疫和體液免疫，是鴨瘟病毒的優(yōu)勢結(jié)構(gòu)蛋白和主要的免疫原性蛋白，也是新型疫苗研究的靶抗原[3]。

對鴨瘟病毒進行全基因測序，與GenBank中發(fā)表的強毒株和弱毒株序列對比發(fā)現(xiàn)，UL2、UL12、UL41、UL47、US10基因在強毒株與弱毒株之間出現(xiàn)明顯的序列差異，提示這5個基因可能與病毒毒力相關(guān)[4-5]。劉榮昌等[6]對福建2個疑似鴨瘟鴨場進行鴨瘟病毒分離，并對UL2基因進行序列測定與分析，發(fā)現(xiàn)分離的鴨瘟病毒具有強毒株的分子特征。許夢微等[7]利用LORF11在不同毒株的序列長度差異建立了鑒別診斷鴨瘟病毒的PCR方法。強弱毒株差異基因分析對鴨瘟毒株毒力分析具有重要意義。

2016年年初，浙江省一免疫過鴨瘟疫苗的蛋鴨場鴨群發(fā)病，病鴨表現(xiàn)為頭腫，眼瞼腫脹、流淚，剖檢可見病鴨脾臟出血、壞死，食道黏膜、泄殖腔黏膜出血，疑似鴨瘟。經(jīng)過PCR方法鑒定，確定該病毒為鴨瘟病毒。本研究通過高通量測序技術(shù)，對所獲得的鴨瘟毒株進行測序，分析該毒株毒力基因序列，確定該毒株的主要功能基因序列特征，旨在為鴨瘟的診斷和防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

病死鴨肝臟、肺臟、十二指腸、輸卵管等組織采自浙江省某暴發(fā)鴨瘟蛋鴨場，總核酸提取試劑盒購自羅氏公司，PCR反應(yīng)試劑購自Takara公司，基因測序所有試劑和耗材購自賽默飛世爾公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物

根據(jù)GB/T 22332—2008《鴨病毒性腸炎診斷技術(shù)》，合成UL6鑒定基因引物。

1.2.2 DNA提取與PCR擴增

采集病死鴨肝臟、肺臟、十二指腸、輸卵管等組織，加入磷酸鹽緩沖液(0.01 moL·L-1，pH 7.4)，組織研磨器上勻漿，反復(fù)凍融3次后，8 000 r·min-1離心10 min，取上清200 μL，采用羅氏公司總核酸提取試劑盒進行核酸抽提，具體操作過程按照說明書進行，提取的總核酸立即進行PCR反應(yīng)或凍存于-80 ℃?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系與程序按照GB/T 22332—2008《鴨病毒性腸炎診斷技術(shù)》進行。

1.2.3 序列測定

采用Ion XpressTMPlus Fragment建庫試劑盒進行測序文庫構(gòu)建，操作方法按照試劑盒說明書進行。構(gòu)建好的文庫使用Ion S5測序系統(tǒng)和Ion Torrent二代測序平臺進行測序。

1.3 分析

采用Torrent server插件將獲得的測序原始數(shù)據(jù)在Ion Torrent平臺進行拼接后，于NCBI上進行Blast分析。利用DNAstar軟件與GenBank上已發(fā)表的鴨瘟病毒的等位同源序列進行對比分析，其中包括CV株(JQ673560.1)、CHv株(JQ647509.1)、VAC株(EU082088.2)、2085株(JF999965)；LH2011株的US10(KC480263.1)、UL2(KC480262.1)、UL12(KC480261.1)、UL41(KC480260.1)、UL47(KC480259.1)；clone-03株的US4-8、US10 (HQ009801.1)、UL12 (EF524094.1)、US10 (EF524095.1)、UL2 (EF449516.1)、gH(DQ227740.1)；strain attenuated strain 1UL2(JQ347517.1)；strain attenuated strain 2UL2(JQ347518.1)。

2 結(jié)果與分析

2.1 擴增結(jié)果及鑒定

用1.0%瓊脂凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，結(jié)果在420 bp左右出現(xiàn)目的DNA條帶，和預(yù)期大小相符。將條帶回收，連接至pMD18-T載體，挑取單菌落鑒定后送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，將測序結(jié)果提交至NCBI上進行檢索，發(fā)現(xiàn)該序列與已發(fā)表的鴨瘟UL6基因序列同源性為99%。

2.2 囊膜蛋白分析

通過測序及序列分析，將ZJ2016株囊膜蛋白gK、gN、gC、gB、gH、gM、gL、gG、gJ分別與我國強毒株CHv株、CV株、歐洲強毒株2085株、疫苗株clone-03株及VAC株進行比較。各毒株間氨基酸變化較小，囊膜蛋白的氨基酸同源性均在99%以上(gI除外)，gK、gN、gC、gH、gD的氨基酸序列同源性達到100%。gB、gM、gL、gG、gJ發(fā)生個別氨基酸的變化。gI氨基酸變化較多主要是疫苗株VAC在長度及個別氨基酸上的變化明顯。gE蛋白的變化主要集中在歐洲株2085與我國毒株的區(qū)別(表1)。

2.3 毒力基因分析

2.3.1LORF11基因序列分析

測序結(jié)果顯示，ZJ2016株鴨瘟病毒LORF11基因編碼區(qū)大小為4 341 bp。將該序列與數(shù)據(jù)庫中其他毒株比對分析發(fā)現(xiàn)，該基因結(jié)構(gòu)出現(xiàn)4種類型(圖1)。ZJ2016株與中國分離的強毒株CHv、LH2011、CV株的同源子閱讀框結(jié)構(gòu)一致，為A結(jié)構(gòu)類型。LORF11基因分為2個ORF，LORF11A和LORF11B。ZJ2016株、CHv株、CV株中間有861個堿基間隔，而LH2011株則有862個堿基間隔。國外毒株2085株、D11-JW-016株、Jasen株、Hollamd株呈現(xiàn)B結(jié)構(gòu)，與A結(jié)構(gòu)相比，總體序列有1 170 bp的序列缺失，5’端有493 bp的序列與LORF11A序列具有高度同源性，缺失序列間隔后有2 678 bp序列具有高度同源性，其中包含了完整的LORF11B序列。中國疫苗株clone-03中間缺失1 929 bp的序列，兩端各有635、1 777 bp的序列分別與LORF11A、LORF11B高度同源，呈現(xiàn)C結(jié)構(gòu)。另一疫苗株VAC則缺失3 513 bp的序列，兩端只有647、181 bp的序列具有高度同源性，為D型結(jié)構(gòu)。

ZJ2016株LORF11A氨基端與LH2011同源性最高，達到99.6%，有1個氨基酸發(fā)生了改變；與CHv株同源性為98.7%，有2個氨基酸發(fā)生了改變。與B結(jié)構(gòu)毒株相比，ZJ2016株與歐洲株2085、D11-JW-016、Jasen株有164個氨基酸完全相同，與Holland株有2個氨基酸不同，分別與疫苗株clone-03、VAC株有211、215個氨基酸同源性100%(圖2)。

ZJ2016株LORF11B羧基端與LH2011株、CHv株同源性分別為99.9%和99.1%，與疫苗株clone-03、VAC株分別有563、59個氨基酸同源性100%(圖3)。研究發(fā)現(xiàn)，LORF11在馬立克病毒中與復(fù)制機制和毒力密切相關(guān)。不同毒株間仍存在個別氨基酸的差異，但這些差異并沒有明顯的規(guī)律。這可能與地方毒株有一定關(guān)系，但是否與毒力相關(guān)還需要進一步驗證。

表1 ZJ2016毒株的囊膜蛋白的氨基酸與其他病毒株的比對結(jié)果Table 1 Comparison of amino acids of envelope protein of ZJ2016 strain with other strains

圖1 LORF11基因結(jié)構(gòu)類型Fig.1 Gene structure types of LORF11

紅色框線為變化氨基酸位置。下圖同。The red frame indicated different amino acids. The same as below.圖2 LORF11A氨基酸比對結(jié)果Fig.2 Amino acid comparison results of LORF11A

2.3.2UL2基因序列分析

UL2基因編碼一種尿嘧啶DNA糖基化酶，該酶被證實在HSV的DNA復(fù)制中起著重要作用。測序分析結(jié)果顯示，ZJ2016株UL2編碼區(qū)全長為1 002 bp，將序列進行Blast比對，各毒株的基因整體結(jié)構(gòu)分為2種類型(圖4)。強、弱毒株在氨基酸水平差異明顯，主要表現(xiàn)在氨基酸的N端。ZJ2016株與強毒株CHv、CV、國外毒株2085均有100%的核苷酸同源性，基因組結(jié)構(gòu)為E型。疫苗毒株clone-03株、疫苗株VAC株、Attenuated strain 1株、Attenuated strain 2株基因結(jié)構(gòu)均在中間有528 bp的缺失，基因結(jié)構(gòu)為F型。但VAC株在堿基缺失后的序列中比其他序列多出3個堿基，從而出現(xiàn)連續(xù)18個氨基酸發(fā)生了改變(圖5)。這種氨基酸的改變因在強弱毒株中均有出現(xiàn)，因此可能與毒力強弱無關(guān)。

2.3.3UL12基因序列分析

UL12基因在HSV-1中編碼堿性核酸酶，在HSV-1的復(fù)制中起著重要作用[8-9]。ZJ2016株UL12基因氨基酸數(shù)量為562個，與CHv株、CV株、LH2011株和歐洲株2085氨基酸同源性為99.8%，僅在385位氨基酸發(fā)生了變化，而與疫苗株差異明顯。疫苗株clone-03株UL12基因只有446個氨基酸，442～446氨基酸無同源性。VAC株UL12基因包含483個氨基酸，氨基端缺失79個氨基酸(圖6)。該結(jié)果提示，UL12氨基酸的變化可能導(dǎo)致疫苗毒株的毒力減弱。

2.3.4UL41基因序列分析

UL41基因編碼的蛋白為鴨瘟病毒宿主關(guān)閉蛋白。研究證實，皰疹病毒的宿主關(guān)閉蛋白的作用是極大地增加了細胞質(zhì)中mRNA降解速度[10-11]。ZJ2016株與CV株及疫苗株VAC、clone-03株氨基酸長度相同，含有498個氨基酸，強毒株CHv株、LH2011株、2085株則含有497個氨基酸，但CHv株與其他2個毒株缺失氨基酸的位置不同。ZJ2016株氨基酸與CV株、CHV株同源性最高，達到99.8%，與其他毒株同源性為99.6%。在第44位氨基酸上，強毒株為谷氨酸，疫苗株為甘氨酸，表明該氨基酸可能與毒株強弱有關(guān)。在166(165)位，ZJ2016株與LH2011株、2085株及Clone-03株、VAC株相同。在303(302)位，ZJ2016株、CV株、CHv株、疫苗株相同，LH2011株與歐洲株2085相同(圖7)，提示該氨基酸可能與地方株無關(guān)。

圖3 LORF11B氨基酸結(jié)果比對結(jié)果Fig.3 Amino acid comparison results of LORF11B

圖4 UL2基因結(jié)構(gòu)類型Fig.4 Gene structure types of UL2

圖5 UL2氨基酸比對結(jié)果Fig.5 Amino acid comparison results of UL2

圖6 UL12氨基酸比對結(jié)果Fig.6 Amino acid comparison results of UL12

2.3.5UL47基因序列分析

UL47基因編碼的蛋白VP13/14是皰疹病毒中最主要的皮層蛋白。研究表明，UL47基因的缺失可導(dǎo)致HSV-1、PRV、MDV病毒滴度的減少，并最終影響病毒復(fù)制[12-14]。同時，UL47基因編碼的蛋白還被證明參與病毒的體液免疫[15-16]。測序結(jié)果(圖8)顯示，ZJ2016株UL47序列與CHv株序列完全相同，比歐洲強毒株2085和中國強毒株LH2011多出1個氨基酸。氨基酸比對分析發(fā)現(xiàn)，在第36位氨基酸上，ZJ2016與3個強毒株一樣為丙氨酸，而疫苗株Clone-03與VAC株為纈氨酸，提示該氨基酸可能與病毒毒力相關(guān)。在113位、148位、598(599)位，2085株與LH2011株相同，而ZJ2016株則與CHv株和2株弱毒疫苗株完全相同(圖8)。

圖7 UL41氨基酸比對結(jié)果Fig.7 Amino acid comparison results of UL41

圖8 UL47氨基酸比對結(jié)果Fig.8 Amino acid comparison results of UL47

2.3.6US10基因序列分析

在鴨瘟病毒中，US10是病毒復(fù)制的非必需基因[17-19]。皰疹病毒HSV-1的US10基因編碼衣殼、皮層相關(guān)聯(lián)的磷酸化蛋白[20]。ZJ2016株的US10序列與強毒株CHv株、CV株、2085株、LH2011株氨基酸長度相同，只在87位發(fā)生了由P到Q的變化。與弱毒株相比，氨基酸變化主要發(fā)生在C端，整個基因序列多出11個氨基酸，但羧基端有很大不同(圖9)，提示可能與毒力相關(guān)。

圖9 US10氨基酸比對結(jié)果Fig.9 Amino acid comparison results of US10

3 討論

本試驗從臨床發(fā)病的鴨場中分離的病料，經(jīng)PCR鑒定后確定為鴨瘟病毒。近年來，我國養(yǎng)鴨場中常出現(xiàn)已免疫鴨群發(fā)病的情況，疫苗免疫失敗的原因可能與疫苗免疫技術(shù)、鴨場自身因素及病毒毒株變異導(dǎo)致免疫保護下降等因素相關(guān)。

皰疹病毒中，囊膜蛋白是主要的保護性抗原，在病毒的結(jié)構(gòu)、功能和毒力等方面發(fā)揮著重要作用。囊膜蛋白序列分析可為鴨瘟的有效防控提供有效線索。本研究中，ZJ2016株囊膜蛋白在氨基酸變化較小，與疫苗株共有5個囊膜蛋白(gK、gN、gC、gH、gD)氨基酸序列同源性達到100%，gB、gM、gL、gG、gJ、gE雖有個別氨基酸發(fā)生變化，但同源性都在99%以上。gI蛋白因疫苗株VAC株氨基酸序列長度不同導(dǎo)致與其他毒株同源性較低。陳柳等[21]研究發(fā)現(xiàn)，gI基因為鴨瘟病毒的非必需基因，且與病毒的擴散和免疫保護能力相關(guān)。比較各強毒株囊膜蛋白基因序列發(fā)現(xiàn)，不同毒株間囊膜蛋白基因序列具有高度的保守性。本研究也證明，ZJ2016株并未發(fā)生明顯變異，免疫失敗并非由于流行野毒發(fā)生變異所致。

ZJ2016株的LORF11、UL2、UL12、UL41、UL47、US10等基因均與強毒株特征一致。其中，與疫苗株相比，LORF11、UL2、UL12、US10基因發(fā)生堿基插入，導(dǎo)致基因結(jié)構(gòu)及氨基酸發(fā)生變化，提示這些基因可能與鴨瘟病毒的毒力相關(guān)。同時，ZJ2016株在個別基因上也發(fā)生了特征性的改變，其變化是否對毒力產(chǎn)生有效影響還需進一步研究。鴨瘟致病機理的研究應(yīng)重點關(guān)注強弱毒株差異基因。

本研究通過基因二代測序技術(shù)對獲得的鴨瘟病毒毒株進行了測序，分析了囊膜蛋白基因與強弱毒株差異基因的變化。研究結(jié)果顯示，該場發(fā)生的鴨瘟病毒具有強毒株的顯著特征，但毒株并未發(fā)生明顯的變異，目前鴨瘟疫苗仍能提供有效保護，發(fā)病原因可能是多種原因?qū)е碌拿庖呤　?/p>