秦 玲，張 鑫，榮春笑，莫傳園，范 露，閆 婕，孟 瑩，張滿讓，*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué) 園藝學(xué)院，陜西 楊凌 712100； 2.洛南縣林業(yè)局，陜西 商洛 726100)

多胺(polyamine，PA)是普遍存在的低分子量有機(jī)陽離子，包括腐胺(putrescine，Put)、亞精胺(spermidine，Spd)、精胺(spermine，Spm)和熱精胺(thermospermine，T-spm)[1]。大量研究表明，PA在植物生長和發(fā)育過程中是必不可少的，包括花芽分化、開花調(diào)節(jié)、生殖器官發(fā)育、性別分化、果實生長和衰老[2]。據(jù)報道，兩種類型的胺氧化酶，包括含銅胺氧化酶(copper-containing amine oxidases， CuAOs)和FAD依賴性多胺氧化酶(FAD-dependent polyamine oxidases， PAOs)參與PA的分解代謝[3]。植物PAO負(fù)責(zé)末端分解代謝或PA的反向轉(zhuǎn)化，從而產(chǎn)生相應(yīng)的二氨基丙烷和氨基醛，并釋放過氧化氫(H2O2)[4-5]。

目前，PAO基因家族成員的鑒定已在擬南芥[6]、水稻[7]、大麥[8]、玉米[9]、煙草[10]、楊樹[11]、甜橙[12]、陸地棉[13]、番茄[14]等植物中有過報道，且在不同植物中PAO家族成員的數(shù)量表現(xiàn)出差異性。例如，擬南芥含有5個PAO基因(AtPAO1-AtPAO5)，甜橙含有6個PAO基因(CsPAO1-CsPAO6)，水稻含有7個PAO基因(OsPAO1-OsPAO7)，陸地棉含有12個PAO基因(GhPAO1-GhPAO12)。到目前為止，擬南芥、水稻和番茄等模式植物中PAO基因家族得到廣泛關(guān)注和研究，但木本植物中關(guān)于PAO家族成員的研究還比較少，僅在蘋果中報道過兩種編碼PAO的cDNA(MdPAO1和MdPAO2a)[15]，但沒有對蘋果PAO基因家族進(jìn)行系統(tǒng)完整的生物學(xué)分析。

根據(jù)研究表明，植物中的PAOs通常分為4個亞家族[16-17]。亞家族Ⅰ的成員參與Spm的反向轉(zhuǎn)化，位于細(xì)胞質(zhì)中；亞家族Ⅲ和Ⅳ的成員在Spm逆轉(zhuǎn)化途徑中也起到降解PAs的作用，前者位于細(xì)胞質(zhì)中[5，18]，后者位于過氧化物酶體中[7]。而亞家族Ⅱ的成員負(fù)責(zé)PAs的最終分解代謝，位于外質(zhì)體[19]或液泡中[20]。

PA參與對生物和非生物脅迫的防御反應(yīng)[1]。研究表明，利用轉(zhuǎn)基因方法和外源PA可增強(qiáng)植物對鹽脅迫的耐受性[21]。植物PAO負(fù)責(zé)PA末端分解代謝或反向轉(zhuǎn)化，這些氧化途徑可能影響PA穩(wěn)態(tài)并調(diào)節(jié)激素信號，從而改變植物對脅迫的耐受性[22]。在三個主要的PA中，Spd與植物的脅迫耐受性聯(lián)系更密切[23]。本實驗通過外源Spd處理，分析在植物生理生化進(jìn)程中PAO編碼基因在轉(zhuǎn)錄水平上的相對表達(dá)量，研究蘋果PAO基因在PA代謝中的可能作用，為進(jìn)一步研究PAO基因在脅迫中的功能提供依據(jù)。另外，有關(guān)蘋果PAO基因家族成員系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析也鮮見報道。本研究根據(jù)已有的金冠基因組數(shù)據(jù)庫和相關(guān)的生物信息學(xué)方法，系統(tǒng)鑒定蘋果PAO家族成員，分析其進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)和基因組織表達(dá)等，研究不同組織(花、莖、葉和果實)中其表達(dá)量的變化規(guī)律，為深入研究蘋果PAO基因的功能提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料和樣品采集

在TAIR網(wǎng)站(http：//www.arabidopsis.org/)根據(jù)文獻(xiàn)報道的基因登錄號下載擬南芥5個AtPAO的基因序列和蛋白序列[6]。在GDR蘋果全基因組數(shù)據(jù)庫Blastp工具中初步比對獲得蘋果中候選PAO基因登錄號，在金冠參考基因組數(shù)據(jù)庫中下載其相應(yīng)的蛋白序列、基因序列、基因定位及基因注釋信息。在NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中根據(jù)文獻(xiàn)報道的基因登錄號下載多個來源于單子葉和雙子葉植物的PAO蛋白序列，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。在GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE42873) 中得到金冠以及不同蘋果雜交種中不同器官的PAO基因表達(dá)數(shù)據(jù)(GSE42873)。

實驗于2019年在陜西省西北農(nóng)林科技大學(xué)寶雞千陽蘋果試驗示范站(107°13′E，34°65′N) 進(jìn)行。材料選自七年生長富2號/M26/八棱海棠，植株行距為1.3 m × 4.0 m，果園采用統(tǒng)一的矮化密植高紡錘形栽培模式，樹勢中庸。選取負(fù)載量和長勢基本一致的植株18株，分成6個小區(qū)，每個小區(qū)3棵樹。根據(jù)曹尚銀等[24]研究，隨機(jī)選擇3個小區(qū)在盛花期后25 d(2019年5月5日)和盛花期后30 d(2019年5月10日)對整樹噴施1×10-5mol·L-1Spd兩次，其他3個小區(qū)噴施清水作為對照。所有處理采用手動噴霧器，噴施的濕潤程度為葉片和莖表面充分濕潤但無液滴凝聚下落。

在對照植株中，于盛花期采集短枝頂花，盛花期后30 d采集幼果(直徑2 cm左右)、短枝頂芽毗鄰葉和短枝莖(直徑2～3 mm)[25]，用于組織特異性分析。對所有植株，于盛花期后30 d開始，分別在生理分化前、中、后期采集長富2號的葉片(短枝頂芽毗鄰葉)，共采集3次(盛花期后30、50、70 d)[26]，對PAO基因進(jìn)行表達(dá)分析。所有采集材料(莖，花，葉，幼果包括果肉和果皮) 均用液氮冷凍處理，-80 ℃保存，用于RNA提取。

1.2 PAO基因家族成員的鑒定與多重序列比對分析

以獲得的5個AtPAO基因的蛋白序列作為檢索依據(jù)，在蘋果基因組數(shù)據(jù)庫GDR中進(jìn)行Blastp比對(https://www.rosaceae.org/blast/protein/protein)，選擇估計值小于e-5的蘋果基因登錄號[27]，去掉重復(fù)的基因。依據(jù)在金冠參考基因組數(shù)據(jù)庫中下載的相應(yīng)蛋白序列，利用Pfam數(shù)據(jù)庫(https://pfam.xfam.org/search/sequence)確定只含有氨基氧化酶結(jié)構(gòu)域(PF01593)的基因，最終鑒定出蘋果PAO基因。根據(jù)染色體的位置情況對蘋果中的PAO依次命名。利用ExPaSy在線網(wǎng)站(https://web.expasy.org/protparam/) 分析MdPAO蛋白的理化性質(zhì)[28]。

利用DNAMAN軟件，采用系統(tǒng)默認(rèn)參數(shù)值，對蘋果MdPAO和玉米ZmPAO1蛋白進(jìn)行多重序列比對[29]。

1.3 MdPAO系統(tǒng)進(jìn)化分析

通過文獻(xiàn)報道的基因登錄號在NCBI中下載獲得多個單子葉和雙子葉植物的PAO蛋白序列[12，14]，利用MEGE6.0軟件構(gòu)建多物種系統(tǒng)進(jìn)化樹，來探討PAO蛋白的進(jìn)化關(guān)系，并分析得出蘋果MdPAO所屬亞家族。方法采用鄰接法(neighbor-joining，NJ)，校驗參數(shù)選擇Bootstrap重復(fù)1 000次，模式采用p-diastance model，缺口設(shè)置選擇partial deletion[30]。

1.4 MdPAO蛋白結(jié)構(gòu)與亞細(xì)胞定位預(yù)測與分析

SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html)在線工具對MdPAO蛋白的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測[31]，包括分析其α-螺旋、β-折疊和無卷曲情況。并在線利用PHYRE serve v2. 0(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2htmlpage.cgi？id=index)對MdPAO蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測[32]。

利用在線網(wǎng)站W(wǎng)oLF PSORT (https://wolfpsort.hgc.jp/)預(yù)測MdPAO蛋白的亞細(xì)胞定位[33]。

1.5 基因結(jié)構(gòu)、保守蛋白分析和啟動子順式作用元件分析

MdPAO基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)示意圖利用在線工具Gene Structure Display Serve 2.0(GSDS)(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)獲得[34]。MdPAO蛋白的保守基序分析利用MEME (http://meme-suite.org/tools/meme)在線網(wǎng)站完成，設(shè)置最大保守基序數(shù)量為10，其余參數(shù)為默認(rèn)設(shè)置值[35]。從金冠基因組數(shù)據(jù)庫中選取MdPAO基因轉(zhuǎn)錄起始位置(ATG)上游1 500 bp的序列作為啟動子區(qū)，利用在線數(shù)據(jù)庫PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，對其啟動子的順式作用元件進(jìn)行分析[36-37]。

1.6 PAO基因表達(dá)分析

采用改良CTAB法[38]提取不同組織部位的總RNA，取完整性良好的總RNA經(jīng)RNase-Free DNase處理之后，去除含有的蘋果DNA。使用TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent試劑盒，按照產(chǎn)品說明書合成cDNA。

利用實時熒光定量PCR分析MdPAO基因在不同組織與亞精胺處理中的表達(dá)情況。采用軟件Primer premier 5.0設(shè)計MdPAO特異性引物(表1)，由于MdPAO2和MdPAO3擁有相似的編碼序列，不能設(shè)計特異性引物區(qū)分，所以它們共用一對引物；MdPAO5和MdPAO6也擁有相似的編碼序列，因此共用一對引物。內(nèi)參基因選用蘋果EF-1α(GenBank 登錄號DQ341381)，其特異性引物為：EF-1α-F，5′-ATTCAAGTATGCCTGGGTGC-3′；EF-1α-R，5′-CAGTCAGCCTGTGATGTTCC-3′[39]。以上述cDNA為模板，參照試劑盒TaKaRa SYBR? Premix EXTaqTMⅡ說明書在QuantStudio5定量儀上進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系為10 μL(其中SYBR? Premix ExTaqTMⅡ 2×為5 μL，上、下游引物各0.5 μL，引物濃度為10 μmol·L-1，cDNA為1 μL，ddH2O為3 μL)。反應(yīng)程序為95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40次循環(huán)[40]，均設(shè)置3次重復(fù)，用2-ΔΔCt方法計算基因的相對表達(dá)量[41]。

利用GEO在線數(shù)據(jù)庫對MdPAO基因的組織特異性進(jìn)行分析。從GEO數(shù)據(jù)庫(登錄號為GSE42873)下載金冠以及不同蘋果雜交種不同器官的基因表達(dá)數(shù)據(jù)，從中提取MdPAO相關(guān)基因的表達(dá)量[42]，并利用HEML1.0軟件作圖。

1.7 數(shù)據(jù)處理及圖表制作

所有數(shù)據(jù)(表示為3次重復(fù)的平均值)在IBM SPSS v19中進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)，采用Duncan的多范圍檢驗(P<0.05)進(jìn)行顯著性分析。相關(guān)圖表制作使用Excel 2010。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋果PAO基因家族成員的鑒定

通過生物信息學(xué)手段，以擬南芥AtPAO的基因家族為檢索靶標(biāo)，從蘋果基因組中獲得了8個PAO基因，根據(jù)其染色體的位置，分別命名為MdPAO1-MdPAO8(表2)。

通過在線網(wǎng)站ExPaSy對MdPAO基因和MdPAO蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果如表2所示。MdPAO基因的CDS序列長度較長，均為1 400 bp以上，其中MdPAO6的CDS序列最長；MdPAO蛋白包含490(MdPAO4)～582(MdPAO6)個氨基酸，分子量在54.053(MdPAO4)～64.813(MdPAO6)ku，等電點介于5.16(MdPAO3)～6.02(MdPAO5)，均略小于7，呈酸性，是酸性蛋白。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，所有MdPAO蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)均小于40，證明都是穩(wěn)定蛋白。MdPAO5平均親水性系數(shù)大于0，其余MdPAO蛋白都小于0，即MdPAO5的疏水性最強(qiáng)，其余MdPAO蛋白均有很好的親水性，且親水程度不同。另外，這8個MdPAO基因分別定位在2號、9號、15號和17號染色體上，其中2號和9號染色體都富集了3個MdPAO基因，15號和17號染色體上均僅存在1個MdPAO基因。這些結(jié)果可以為研究MdPAO蛋白的功能提供借鑒。

2.2 MdPAO蛋白結(jié)構(gòu)分析

為了研究MdPAO蛋白序列的特征，用DNAMAN軟件對MdPAO和ZmPAO1進(jìn)行多重蛋白序列的比對。結(jié)果顯示(圖1)，MdPAO成員與ZmPAO1表現(xiàn)出不同的序列同源性，MdPAO成員之間也表現(xiàn)出差異性。該分析預(yù)測了MdPAO4、MdPAO6和MdPAO8中過氧化物酶體靶向序列的存在。

表1 MdPAO定量引物序列Table 1 Primer sequenceces of MdPAO genes

表2 MdPAO基因家族Table 2 MdPAO gene family

灰色背景著色為相同和相似的氨基酸殘基；序列上方的黑線表示人類MAO-B和ZmPAO1的FAD結(jié)合區(qū)域[6，43]；黑色方框表示過氧化物酶體靶向信號[23，44]。Gray background colored were the identical and similar amino acid residues；Black lines above the residue indicated the FAD binding region of human MAO-B and ZmPAO1[6，43]; Black boxes represented peroxisome targeting signals[23，44].圖1 MdPAO和ZmPAO1氨基酸序列的比對Fig.1 Alignment of the amino acid sequence of MdPAO and ZmPAO1

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化分析

為了研究不同物種PAO的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，利用MAGE軟件，采用NJ法構(gòu)建了一個包含36條來自不同物種的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)，其中蘋果8條，擬南芥5條，甜橙6條，水稻7條，番茄7條，大麥2條，玉米1條。結(jié)果顯示，蘋果MdPAO與番茄、擬南芥和甜橙的PAO親緣關(guān)系較近，與水稻、玉米和大麥親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，原因可能是蘋果與甜橙和番茄等雙子葉植物分離進(jìn)化時間更近。

結(jié)果表明，PAO家族分為4個亞家族，且每個亞家族內(nèi)，基因數(shù)分布不均勻，分別包含4、8、8和16個。其中MdPAO3屬于亞家族Ⅰ；而沒有蘋果MdPAO屬于亞家族Ⅱ；3個蘋果MdPAO(MdPAO1、MdPAO2和MdPAO7)屬于亞家族Ⅲ；4個蘋果MdPAO(MdPAO4、MdPAO5、MdPAO6和MdPAO8)屬于亞家族Ⅳ。

2.4 蛋白結(jié)構(gòu)和亞細(xì)胞定位分析

利用在線網(wǎng)站ExPaSy對MdPAO蛋白進(jìn)行一級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，發(fā)現(xiàn)同一亞家族成員氨基酸的組成與含量相差較??；不同亞家族成員之間差異較大。利用在線網(wǎng)址SOPMA對MdPAO蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測的結(jié)果顯示(表3)，MdPAO蛋白的二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成，其中主要組成部分是α-螺旋和無規(guī)則卷曲，延伸鏈次之，β-轉(zhuǎn)角占很小的一部分(6%左右)。二級結(jié)構(gòu)進(jìn)一步折疊形成三級結(jié)構(gòu)(圖3)，利用PHYRE serve v2.0預(yù)測MdPAO蛋白的三級結(jié)構(gòu)，同源性越高，其相似度越高。

蛋白序列由文獻(xiàn)報道的基因登錄號在NCBI查詢獲得[12，14]。The protein sequence was obtained from the NCBI query by the gene landing number reported in the literature[12，14].圖2 多個物種中PAO蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.2 Phylogenetic tree of PAO proteins of different varieties

利用在線網(wǎng)址WoLF PSORT預(yù)測MdPAO亞細(xì)胞定位，呈現(xiàn)出明顯的亞家族特征，且分布廣泛(表3)。亞家族Ⅰ中MdPAO3位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；亞家族Ⅲ中的MdPAO1～2位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其中 MdPAO7位于葉綠體；亞家族Ⅳ中MdPAO4、6和8位于過氧化物酶體，而MdPAO5位于葉綠體。

2.5 基因結(jié)構(gòu)和保守蛋白分析

利用在線網(wǎng)站GSDS和MEME對MdPAO的基因結(jié)構(gòu)和保守基序進(jìn)行了分析，如圖4所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同一亞家族的成員表現(xiàn)出相似的基因結(jié)構(gòu)和蛋白保守基序分布，比如亞家族Ⅲ中MdPAO1～2和MdPAO7都只含有1個外顯子，無內(nèi)含子和5′/3′非翻譯區(qū)，都擁有motif1、motif3、motif4、motif6、motif7、motif8、motif9和motif10；亞家族Ⅳ中MdPAO4～6和MdPAO8擁有10個或13個外顯子，都擁有motif1、motif2、motif4和motif9，但也存在差異，其中MdPAO5缺失motif6，MdPAO4和MdPAO8缺失motif5。另外，亞家族Ⅰ中的MdPAO3具有10個外顯子，擁有motif1和motif6。

2.6 啟動子順式作用元件分析

利用PLANTCARE在線網(wǎng)址分析啟動子及其上游序列的順式作用元件，預(yù)測基因的功能，結(jié)果如圖5所示，8個PAO都具有與光響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件；其次，茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(methyl jasmonate，MEJA)除MdPAO5和MdPAO8外，在其他成員中均有發(fā)現(xiàn)；厭氧響應(yīng)元件(anaerobic)除MdPAO5和MdPAO7外，在其他成員中也均有發(fā)現(xiàn)；另外，在8個PAO中還存在與水楊酸(salicylic acid)、脫落酸(abscisic acid)、赤霉素(gibberellin)、生長素(auxin)、干旱(drought)和低溫(low-temperature)相關(guān)的順式作用元件。這些存在的調(diào)控元件說明MdPAO基因家族受到脅迫和多種激素的影響。

圖3 MdPAO三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測Fig.3 Tertiary structures of MdPAO proteins

表3 MdPAO蛋白一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位預(yù)測Table 3 Primary analysis， secondary analysis and subcellular predication of MdPAO

2.7 MdPAO在不同組織中的表達(dá)分析

為了探討MdPAO在不同組織中的表達(dá)特性，試驗采用GEO在線網(wǎng)站分析和實時熒光定量PCR兩種方法。從GEO數(shù)據(jù)庫中下載10個基因型(M69、M74、M20、M14、M49、GD、X8877、X4442、X4102和X3069)蘋果的不同器官的基因表達(dá)量，利用HemI軟件制作熱圖。從圖6中可以發(fā)現(xiàn)，MdPAO4在不同品種和器官中的表達(dá)量均顯著高于其他家族成員，其中在M49的葉和M74的花和果中表達(dá)量最高；MdPAO1～3和MdPAO7表達(dá)水平在M20的果中表達(dá)量最低；MdPAO1～2、MdPAO5～6和MdPAO8在不同雜交種的種子中表達(dá)量也很低。這些結(jié)果表明MdPAO在蘋果不同品種和器官中的表達(dá)水平普遍存在，為MdPAO基因的功能研究提供指導(dǎo)意義。

利用實時熒光定量PCR方法，研究MdPAO基因在蘋果長富2號不同組織器官中(莖、花、果、葉)的表達(dá)模式，以探究MdPAO基因在蘋果生長發(fā)育過程中的作用。由于MdPAO基因結(jié)構(gòu)保守，因此8個基因共設(shè)計出6對引物，如表1所示[45]。MdPAO組織特異性結(jié)果表明(圖7)，同一亞家族的MdPAO1/2和MdPAO7在4個不同組織中的表達(dá)模式相似，在莖和果中的轉(zhuǎn)錄水平顯著高于花和葉中的；同一亞家族的MdPAO5/6和MdPAO8在4個不同組織中的表達(dá)模式也相似，在花中表達(dá)量顯著高于其余3個組織器官；MdPAO3在花和葉中的表達(dá)量顯著高于莖中的，在果中的表達(dá)量也較高；MdPAO4在花中的表達(dá)量顯著高于莖和葉中的，在莖中的表達(dá)量也較高。

A，MdPAO外顯子-內(nèi)含子分析。B，保守蛋白分析，其中1，motif1；2，motif2；3，motif3；4，motif4；5，motif5；6，motif6；7，motif7；8，motif8；9，motif9；10，motif10。C，motif序列。A， An exon-intron analysis of MdPAO. B， Conserved motifs analysis， in picture B: 1， motif1; 2， motif2; 3， motif3; 4， motif4; 5， motif5; 6， motif6; 7， motif7; 8， motif8; 9， motif9; 10， motif10. C， Conserved motifs sequence.圖4 MdPAO基因結(jié)構(gòu)與保守蛋白Fig.4 Gene structure and conserve motifs analysis of MdPAO

2.8 Spd處理對MdPAO相對表達(dá)量的影響

為了研究蘋果MdPAO在PA代謝中的潛在作用，通過外源Spd處理，在植物生理分化3個時期檢測MdPAO的表達(dá)量。結(jié)果如圖8所示，所有MdPAO都響應(yīng)Spd處理，并具有相似的表達(dá)模式。進(jìn)入生理分化期后，MdPAO的轉(zhuǎn)錄水平均是先上升后下降，并在生理分化中期50 d達(dá)到最大值。除了MdPAO4以外，其余MdPAO的表達(dá)水平在生理分化期間均有不同程度的上調(diào)，其中MdPAO1/2在50和70 d顯著高于對照，MdPAO4、MdPAO7和MdPAO8在30和50 d顯著高于對照，而MdPAO3通過外源Spd處理后，沒有顯著變化。

1，茉莉酸甲酯誘導(dǎo)；2，光響應(yīng)；3，厭氧誘導(dǎo)；4，干旱誘導(dǎo)；5，水楊酸誘導(dǎo)；6，脫落酸誘導(dǎo)；7，赤霉素誘導(dǎo)；8，生長素誘導(dǎo)；9，低溫響應(yīng)。1， MeJA-responsiveness; 2， light responsiveness; 3， anaerobic induction; 4， drought-inducibility; 5， salicylic acid responsiveness; 6， abscisic acid responsiveness; 7， gibberellin-responsive; 8， auxin-responsive; 9， low-temperature responsiveness.圖5 啟動子順式作用元件Fig.5 Predicted cis-elements in promoter of MdPAO genes

3 討論

大量的研究已經(jīng)表明，PAO在植物生長和發(fā)育中起到至關(guān)重要的作用。擬南芥等模式植物對PAO家族成員的鑒定和系統(tǒng)進(jìn)化的機(jī)制研究已經(jīng)比較清楚，在蘋果中前人也有報道[16]，但關(guān)于蘋果PAO基因家族的鑒定、特征和功能的系統(tǒng)性分析還未見報道。本實驗共鑒定出8個蘋果PAO家族成員，并系統(tǒng)分析了其進(jìn)化關(guān)系、理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)、啟動子順式作用元件和組織表達(dá)特異性等。

本研究從蘋果基因組中共鑒定出8個MdPAO基因，高于擬南芥、水稻、甜橙和番茄中的成員數(shù)量[6-7，12，14]，這可能與蘋果基因組較大和全基因組復(fù)制有關(guān)[46]。本實驗對8個MdPAO蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)均具有較好的穩(wěn)定性且呈酸性，大部分MdPAO蛋白是親水蛋白。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，MdPAO與擬南芥和番茄等雙子葉植物的PAO蛋白親緣關(guān)系更近，可能來源于同一祖先。植物中的PAO通常分為4個亞家族[7，16-17]，本實驗中系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，8個MdPAO分為3個亞家族，而沒有屬于亞家族Ⅱ的成員。多重蛋白序列比對、蛋白結(jié)構(gòu)、亞細(xì)胞定位預(yù)測和基因結(jié)構(gòu)分析均顯示出同一亞家族的成員具有相似的規(guī)律特征，不同亞家族的成員之間呈現(xiàn)多樣性，這可能與MdPAO的進(jìn)化密切相關(guān)。另外，8個MdPAO基因啟動子上富含茉莉酸甲酯、水楊酸、脫落酸、赤霉素和生長素等激素響應(yīng)元件，并擁有響應(yīng)逆境脅迫相關(guān)的順式作用元件，暗示MdPAO可能參與涉及植物激素和逆境脅迫密切相關(guān)的多個生理過程。

GD，金冠；M69、M74、M20、M14、M49、X8877、X4442、X4102 和X3069為不同蘋果雜交種。GD， Golden Delicious; M69， M74， M20， M14， M49， X8877， X4442， X4102 and X3069 were various apple hybrids.圖6 MdPAO在不同蘋果品種不同組織中的表達(dá)模式Fig.6 Expression profiles of MdPAO gene in different tissues and different apple varieties

不同處理間沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0，05)。下同。Bars marked without the same lowercase letters showed significant difference at P<0.05. The same as below.圖7 MdPAO在長富2號不同組織器官中的表達(dá)模式Fig.7 Expression patterns of MdPAO genes in different tissues in Nagafu No.2

圖8 MdPAO在Spd處理后不同時期的相對表達(dá)量Fig.8 Relative expression levels of MdPAO genes in the leaves treated with Spd at different times

通過GEO數(shù)據(jù)庫和實時熒光定量PCR分析了MdPAO成員在不同器官和組織中的表達(dá)模式，GEO數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)表明，MdPAO成員在蘋果不同品種和器官中普遍表達(dá)，并具有差異性。本研究利用實時熒光定量PCR探究了MdPAO成員在不同組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)8個MdPAO在莖、花、果和葉均有表達(dá)。MdPAO3、MdPAO4、MdPAO5/6和MdPAO8在花中有較高的表達(dá)水平，推測它們在花的生長發(fā)育過程中起到重要作用；MdPAO1/2和MdPAO7在莖和果中有較高的表達(dá)水平，推測它們發(fā)揮功能的部位可能在莖和果中。進(jìn)一步探索MdPAO基因如何在各組織中發(fā)揮功能，還需要進(jìn)行更系統(tǒng)的分子生物學(xué)實驗研究。

基于Spd處理后MdPAO的表達(dá)數(shù)據(jù)表明，MdPAO在PA代謝途徑中發(fā)揮著重要作用。根據(jù)MdPAO成員所在亞家族特征，外源Spd處理后，MdPAO可能參與PA的反向轉(zhuǎn)化途徑，促進(jìn)Spm向Spd、Spd向Put的逆轉(zhuǎn)化，從而維持PA的穩(wěn)態(tài)。MdPAO3沒有顯著變化，推測其不響應(yīng)外源Spd處理，但有待進(jìn)一步驗證。MdPAO在PA代謝中的確切作用還需要使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)或使用蛋白質(zhì)和相關(guān)底物的生化反應(yīng)來闡明。