李美霖，陳宇眺，洪曉富，喬宇穎，4，王青霞，陳喜靖，沈阿林，喻 曼，*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，浙江 杭州 311300； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 環(huán)境資源與土壤肥料研究所，浙江 杭州 310021； 3.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物與核技術(shù)利用研究所，浙江 杭州 310021； 4.西北農(nóng)林科技大學(xué) 資源環(huán)境學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

水稻是我國重要的糧食作物。水稻的生長發(fā)育對各種營養(yǎng)元素，尤其是氮、磷、鉀的需求量很大。氮素是水稻各生育期所必需的重要元素，被認為是限制水稻產(chǎn)量提升的主要因子。近年來，由于耕地面積不斷縮減、生產(chǎn)成本增加，化肥，尤其是氮肥的施用成為了保障水稻單產(chǎn)的關(guān)鍵因素，但由此也導(dǎo)致糧食產(chǎn)量增加和土壤生態(tài)保育之間的矛盾日漸突出[1]。不合理的氮肥施用對土壤結(jié)構(gòu)和肥力造成了不同程度的破壞，并引發(fā)一系列的環(huán)境問題。已有研究表明，在田間管理中，優(yōu)化稻田氮肥管理模式是弱化這一矛盾的重要措施。適當調(diào)整氮肥施入量和施入時間不僅能促進水稻對氮素的吸收利用，還能促進稻田氮素轉(zhuǎn)化，減少農(nóng)田氮肥施用可能帶來的負面環(huán)境影響。目前，關(guān)于稻田氮肥管理的研究主要聚集于對水稻生長發(fā)育和氮肥利用率的影響方面，對稻田生態(tài)系統(tǒng)影響機理的研究較少[2-4]。土壤微生物作為土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要角色，對土壤生態(tài)環(huán)境的變化過程極其敏感。土壤生態(tài)環(huán)境的變化影響土壤微生物群落和結(jié)構(gòu)的動態(tài)變化，而土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的改變也可以反映外界環(huán)境的變化，具有指示作用[5-6]。本研究綜合運用Biolog-Eco微平板法和磷脂脂肪酸(PLFA)法綜合分析不同氮肥管理模式下稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、總體活性和代謝功能的變化，旨在為稻田合理施用氮肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗于2018年在衢州市衢江區(qū)蓮花鎮(zhèn)的大田(118°93′E，28°98′N)開展。該地區(qū)屬中亞熱帶季風(fēng)氣候，溫和濕潤，四季分明，具有春早、秋短、夏冬長的特點。全年日照時數(shù)為1 785～2 118 h，年無霜期為224～246 d，年平均氣溫為15.5～16.0 ℃，全年最高氣溫出現(xiàn)在7月，平均氣溫達29.1 ℃，最冷月份為1月，平均氣溫為5.2 ℃。當?shù)赜炅砍渑?，年降水量? 542～1 763 mm，年均降水日為142～155 d，降水多集中在4至6月份[7]。

1.2 試驗設(shè)置

試驗小區(qū)按完全隨機區(qū)組方式排布，共設(shè)置4個處理(表1)，分別為：不施氮肥(CK)，農(nóng)民習(xí)慣施肥(FP)，氮肥優(yōu)化管理1(OPT1)，氮肥優(yōu)化管理2(OPT2)。各處理除N素投入量不同外，P2O5、K2O的投入量相等。每個處理設(shè)置3次重復(fù)，小區(qū)面積27 m2(5.0 m×5.4 m)。

供試品種為甬優(yōu)538(秈粳雜交稻)。播種日期為5月23日；移栽日期為6月21日，秧齡29 d；收獲日期為10月10日。田間水分管理、病蟲害防治同生產(chǎn)實際。

供試復(fù)合肥中N、P2O5、K2O的質(zhì)量分數(shù)分別為15%、15%、15%，緩釋肥中N、P2O5、K2O的質(zhì)量分數(shù)分別為46%、16%、26%，尿素中N的質(zhì)量分數(shù)為46%，過磷酸鈣[Ca(H2PO4)2]中P2O5的質(zhì)量分數(shù)為16.7%，KCl中K2O的質(zhì)量分數(shù)為60%。

水稻收獲后采用5點法取0～20 cm耕層的土壤，然后混合均勻。

1.3 指標測定

1.3.1 Biolog-Eco微平板法

Biolog-Eco微平板法(Biolog-EcoPlateTM)通過記錄各板孔在規(guī)定時間特定波長吸光值的變化來反映微生物群落的代謝活性和功能多樣性[8]。Biolog-Eco板共96孔，分為3個平行，每個平行32個孔?？字泻袪I養(yǎng)鹽和四唑鹽染料TTC，其中1孔不含碳源為對照孔，其他31孔含有不同的單一碳源，微生物對碳源的利用程度可由Biolog-Eco板中每個孔的顏色反映[9]。Biolog-Eco板所用接種液的制備采用Classen等[10]的方法：稱取相當于5 g干土質(zhì)量的鮮土加入到已經(jīng)滅菌的錐形瓶中，加入45 mL無菌水，在搖床上振蕩30 min，轉(zhuǎn)速為180 r·min-1，靜置后吸取1 mL懸浮液離心20 min，棄去上清液，加入1 mL質(zhì)量分數(shù)為0.85%的生理鹽水，在搖床上振蕩5 min，重復(fù)3次，取0.5 mL上清液用質(zhì)量分數(shù)為0.85%的生理鹽水稀釋到Biolog系統(tǒng)所要求的接種濃度，將稀釋后的溶液接種到Biolog-Eco板上，每孔加樣量為150 μL，將接種好的微平板置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，分別于24、48、72、96、120、144、168、192、216、240 h在590 nm處讀取吸光值[10]。

表1 不同處理的施肥管理方案Table 1 Different treatments for fertilization management

1.3.2 PLFA法

土壤總脂質(zhì)的提取參考Yu等[11]的方法：稱取3 g新鮮土壤樣品裝入30 mL玻璃離心管中，加入提取液(磷酸緩沖液、甲醇、氯仿體積比0.8∶2∶1混合而成)提取總脂質(zhì)，然后通過硅膠柱(Waters，500 mg，100～200目)層析分離出PLFA，加入內(nèi)標十九烷酸(C19:0)進行甲酯化反應(yīng)，最后通過氣相色譜(GC)(Agilent 6890)分離檢測PLFA。根據(jù)Sherlock MIS 4.5系統(tǒng)(Sherlock Microbial Identification System)報告和相關(guān)文獻對PLFA進行定性分析，根據(jù)內(nèi)標物進行定量計算。以PLFA總量來估算土壤樣品的微生物生物量[12]。以指示PLFA估算相應(yīng)指示群落的生物量，指示細菌的脂肪酸有i15:0(好氧細菌)、a15:0(好氧細菌)、15:0、i16:0、16:1ω5(甲烷氧化菌)、16:1ω7t、i17:0、a17:0、cy17:0、17:0(節(jié)桿菌屬)、18:1ω7(假單胞桿菌)、18:1ω7t、18:1ω5(厭氧菌)、i19:0、a19:0、cy19:0；指示真菌的脂肪酸有18:1ω9、18:2ω6、18:3ω6、18:3ω3；指示放線菌的脂肪酸有10Me16:0(硫酸鹽還原細菌)、10Me17:0、10Me18:0。

1.4 數(shù)據(jù)處理

土壤微生物群落的代謝活性用31孔的平均吸光值(AWCD)來描述。

采用Biolog-Eco微平板培養(yǎng)120 h的吸光值來計算微生物群落結(jié)構(gòu)的代謝功能多樣性指數(shù)——Shannon-Wiener指數(shù)(H)、Simpson指數(shù)(C)和Pielou均勻度指數(shù)(J)。其中，Shannon-Wiener指數(shù)和Simpson指數(shù)用于評價和比較微生物群落的多樣性；Pielou均勻度指數(shù)用于評價各物種個體數(shù)目分配的均勻程度[13-14]。

用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理，用Canoco 4.5進行主成分分析(PCA)，用Sigma plot 12.5進行分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥管理模式下土壤微生物的碳源利用特征

各處理的AWCD值隨時間的變化能直觀地體現(xiàn)微生物群落的反應(yīng)活性和最終達到的程度[9]。如圖1所示，各處理的AWCD值在開始時均較低，說明其土壤微生物代謝活性均較低，24 h后隨著培養(yǎng)時間延長，土壤微生物的代謝活性逐漸增強，不同處理間出現(xiàn)明顯差異，192 h后趨于平穩(wěn)并達到最高值，各處理的AWCD值從大到小依次為OPT1>CK>FP>OPT2。

圖1 不同處理土壤微生物群落AWCD值隨時間的動態(tài)變化Fig.1 Dynamics of AWCD value of soil microbial communities under different treatments

根據(jù)Biolog-Eco板上31種碳源的化學(xué)基團性質(zhì)，可將其分為6大類碳源[13]：10種屬碳水化合物類，6種屬氨基酸類，4種屬聚合物類，2種屬胺類，2種屬酚酸類，7種屬羧酸類。不同處理下各碳源占總碳源的比例如圖2所示。可以看出，碳水化合物類、氨基酸類、聚合物類和羧酸類是微生物主要利用的碳源。CK和OPT1處理的土壤微生物對6類碳源均有利用，OPT1處理的土壤微生物對胺類和酚酸類的利用占比大于CK，但對碳水化合物類和羧酸類的利用占比小于CK；

圖2 不同處理的土壤微生物AWCD值占比Fig.2 Proportion of AWCD value of soil microbes under different treatments

FP處理的土壤微生物未利用胺類碳源，對酚酸類和羧酸類的利用占比均高于CK，但對氨基酸類的利用占比小于CK；OPT2處理的土壤微生物只利用了4類碳源，對碳水化合物類的利用占比小于CK，但對氨基酸類、聚合物類和羧酸類的利用占比均高于CK。結(jié)果表明，不同施肥管理模式對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)有影響，各組處理的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異，且OPT1處理與OPT2處理的差異明顯。

2.2 不同施肥管理模式下土壤微生物的碳源利用多樣性

如表2所示，各處理的Simpson指數(shù)差異不顯著，而Shannon-Wiener指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)存在顯著(P<0.05)差異，表明不同施肥管理模式對土壤微生物群落多樣性和物種個體分布均勻度具有顯著影響。OPT1處理的土壤微生物群落多樣性和物種均勻度均最高，CK和FP處理的土壤微生物多樣性和物種均勻度相近，OPT2處理的土壤微生物多樣性和物種均勻度最低。OPT1處理顯著(P<0.05)提高了土壤原有的微生物多樣性和物種個體分布的均勻度，而OPT2處理則對土壤微生物多樣性和物種個體分布均勻度有一定的抑制作用。

2.3 不同施肥管理模式下土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)變化

各處理的PLFA微生物生物量和真菌-細菌比(F/B)如圖3所示。各處理的細菌含量明顯高于其他微生物菌群，且真菌含量高于放線菌含量，表明細菌是本試驗條件下水稻土中的優(yōu)勢菌群。OPT1處理的總PLFA含量最高，為42.11 nmol·g-1，CK和OPT2處理分別為34.19 nmol·g-1

表2 不同處理的土壤微生物多樣性分析Table 2 Analysis of soil microbial diversity under different treatments

同列數(shù)據(jù)后無相同小寫字母的表示處理間差異顯著(P<0.05)。
Data marked without the same letters indicated significant difference atP<0.05 in the same column.

圖3 不同處理的土壤PLFA微生物群落含量及F/BFig.3 Microbial content and F/B of PLFA under different treatments

和40.16 nmol·g-1，F(xiàn)P處理最低，為34.16 nmol·g-1。OPT1和OPT2處理的細菌、真菌和放線菌PLFA含量均高于其他處理，說明合適的氮肥優(yōu)化管理處理的PLFA總量高于常規(guī)施肥處理，合理減施氮肥能增加土壤微生物生物量。各組之間F/B差異較小，表明短期內(nèi)不同施肥管理措施對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響不顯著。但是，不同處理對微生物總生物量的影響顯著(P<0.05)。

2.4 不同施肥管理模式下土壤微生物的信息主成分分析

以4種處理培養(yǎng)120 h的AWCD值為依據(jù)，對其碳源利用能力進行主成分分析。如圖4-A所示，PC1的貢獻率為64.09%，PC2的貢獻率為17.99%。PC1中羧酸類、氨基酸類和碳水化合物類利用所占的權(quán)重較高，PC2中酚酸類和胺類利用所占的權(quán)重較高。樣本間距離越近，表明樣本相似程度越高，反之亦然[15]。各處理在PC軸上出現(xiàn)了明顯的分異，且距離較遠，表明各處理的土壤微生物在碳源代謝能力上存在顯著(P<0.05)差異，F(xiàn)P和OPT2處理相較于CK處理的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大，OPT1處理相較于CK處理的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異較小。

圖4 基于不同處理土壤微生物Biolog(A)和PLFA(B)的PCA分析Fig.4 PCA based on soil microbial Biolog (A) and PLFA (B)

各處理PLFA數(shù)據(jù)的PCA結(jié)果如圖4-B所示，PC1和PC2的總貢獻率為91.8%，合起來基本可以反映土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)特征。CK與FP均位于第四象限，OPT1、OPT2分別位于第二、三象限。PLFA單體集中在PC1負半軸，又以O(shè)PT1所在象限居多，表明OPT1與OPT2中微生物信息在PCA載荷圖上起主導(dǎo)作用，同時這2種模式的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)存在一定差異。OPT1的土壤微生物群落與a17:0、cy17:0、18:2ω6、16:1ω5、和a15:0距離較近，說明在OPT1處理中真菌、甲烷氧化菌和好氧細菌起主導(dǎo)作用；OPT2離10Me17:0、18:1ω5、18:1ω7和16:1ω7較近，說明放線菌、厭氧細菌和假單胞桿菌在OPT2中起主導(dǎo)作用。

3 討論與結(jié)論

土壤微生物是由多個種群組成的微生物群落，不同種群之間存在著共生、互利、共存、競爭等各種復(fù)雜的關(guān)系，共同在土壤物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用。研究微生物群落結(jié)構(gòu)及其代謝功能，可以揭示土壤生態(tài)環(huán)境變化的生物學(xué)基礎(chǔ)，提供評價和預(yù)測土壤生態(tài)環(huán)境安全性的基本信息[9]。本試驗測定結(jié)果顯示，Biolog-Eco微平板法和PLFA方法的分析結(jié)果存在一定差異，這可能是由于其方法原理不同導(dǎo)致：PLFA方法通過分析微生物細胞膜磷脂脂肪酸的含量來反映微生物群落結(jié)構(gòu)[16]；而Biolog-Eco微平板法則是通過分析微生物對不同碳源的利用能力來獲得有關(guān)微生物群落總體活性與代謝功能的信息[9]。

施肥對土壤微生物群落的影響存在一定的不確定性，但眾多研究表明，合理的施肥管理模式更有利于提高土壤微生物群落的多樣性和總生物量。李清華等[17]研究表明，黃泥田合理施肥可顯著提高土壤微生物群落數(shù)量與含量；而白震等[18]研究發(fā)現(xiàn)，長期氮磷肥配施或氮磷鉀肥配施抑制了黑土土壤中大多數(shù)菌群的生長；但顏慧等[19]研究認為，施用氮磷鉀肥顯著提高了紅壤土壤微生物總PLFA，以及細菌和放線菌PLFA含量。本研究中，氮肥優(yōu)化管理模式下微生物的總PLFA，以及細菌、真菌和放線菌含量均較高，由此觀之，優(yōu)化氮肥管理處理的施肥方式更為合理。

土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)易受土壤養(yǎng)分和地上部作物的共同影響。植物在環(huán)境養(yǎng)分脅迫時，體內(nèi)會合成特定的根系分泌物，以提高其對養(yǎng)分的吸收利用能力。Liljeroth等[20]研究認為，氮對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響是通過改變根系分泌物間接實現(xiàn)的。崔佩佩等[21]研究發(fā)現(xiàn)，缺氮脅迫提高了高粱根際微生物的代謝活性，增強了其對氨基酸類、羧酸類、胺類、糖類和聚合物類的利用能力，但降低了對雙親化合物的利用，缺氮脅迫下高粱根際土壤微生物的種類和優(yōu)勢度指數(shù)明顯高于其他處理。酚酸類作為Biolog-Eco板中添加的碳源之一，在土壤中多是作物化感作用通過根際釋放到土壤環(huán)境中的次生代謝產(chǎn)物，對抑制伴生雜草有作用[22]。稻田土壤中的酚酸主要是在水稻生長過程中釋放到環(huán)境中的，水稻收獲后，土壤中酚酸的主要來源被切斷，而原有的酚酸被微生物利用降解，致使土壤中的酚酸含量迅速降低[23]。本研究中，OPT1和OPT2處理均提高了微生物代謝活性及其對氨基酸類、羧酸類、胺類、糖類和聚合物類碳源的利用能力，表明氮肥優(yōu)化處理可能通過一定的缺氮脅迫刺激作物根系發(fā)育，從而促進其對養(yǎng)分的吸收利用。OPT1處理的土壤微生物對酚酸類碳源的利用能力高于其他處理，表明該處理土壤中酚酸含量可能較高，這對后期稻田雜草可起到一定的抑制作用，有利于維持稻田健康發(fā)展。

一般認為，真菌與細菌比值越高，表明農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)越穩(wěn)定。真菌的化學(xué)成分較復(fù)雜，其貯存源碳量是細菌的26倍，通過真菌生物量固定的碳比細菌生物量固定的碳更穩(wěn)定持續(xù)。此外，真菌具有菌絲，可以運動、寄居并迅速降解土壤表面的動、植物殘體，有利于有機質(zhì)積累[18]。甲烷氧化菌以甲烷為唯一碳源。土壤中甲烷氧化菌的氧化作用可將土壤中的部分甲烷氧化，減少甲烷排放量，同時增加土壤氮素含量。有研究表明，甲烷氧化菌對土壤甲烷的消耗約占大氣甲烷消耗量的10%[24]。放線菌大部分為好氧菌，少部分為厭氧菌，假單胞桿菌嚴格好氧。水稻收獲后，土壤含水率下降，孔隙度較大，含氧量上升，淺層土壤微生物群落中好氧微生物成為優(yōu)勢菌群。本試驗中，OPT1與OPT2處理均施入緩釋肥，二者的差異僅在于緩釋肥的施用時間不同。OPT1模式的土壤微生物多樣性和總生物量均高于OPT2，且微生物物種個體的分布均勻度大。真菌、甲烷氧化菌和好氧細菌在OPT1處理的土壤微生物中起主導(dǎo)作用，而放線菌、厭氧細菌和假單胞桿菌在OPT2處理的土壤微生物中起主導(dǎo)作用。OPT1的F/B值最高，說明與OPT2處理相比，OPT1處理的土壤含氧量較高，土壤微生物多樣性較復(fù)雜，土壤養(yǎng)分積累較高。由此可見，緩釋肥的施入時間對土壤微生物多樣性和物種個體均勻度影響顯著。水稻是喜銨性作物，但是其不同生育期對銨態(tài)氮、硝態(tài)氮的相對吸收量和比例不同。緩釋肥可協(xié)調(diào)作物養(yǎng)分的供給，使養(yǎng)分在土壤中緩慢釋放，減少養(yǎng)分的損失，肥效期長且穩(wěn)定，能源源不斷地供給作物在整個生育期所需的養(yǎng)分[25-26]。鄭圣先等[27]研究認為，緩控釋肥料供給養(yǎng)分的釋放速度基本能與水稻生長發(fā)育的需求同步，促進了水稻氮素的吸收，提高了氮素利用效率，從而可達到增產(chǎn)效果。周波等[28]研究表明，施用緩釋尿素可提高氮肥利用率，且減肥效果明顯，有益于生態(tài)環(huán)境保護。楊斌華等[29]研究表明，高分子緩控釋化肥在細菌微生物的作用下有80 d的緩釋放周期，養(yǎng)分釋放率達到98%，說明緩釋肥有其特定的緩釋時間，因此施入田間的時間至關(guān)重要。本試驗中，緩釋肥作為基肥施入稻田與水稻的需肥規(guī)律更匹配，能夠有效提高肥料利用率，同時也更有利于提高微生物群落多樣性，進而促進土壤生態(tài)環(huán)境穩(wěn)定。

綜上所述，不同氮肥管理方式對水稻土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響不同。本研究中的農(nóng)民習(xí)慣施肥管理模式降低了土壤微生物含量，微生物代謝活性較弱，利用碳源種類較少；氮肥優(yōu)化管理1顯著增強了土壤微生物的代謝活性和利用碳源的能力，微生物總含量和種類均增加；氮肥優(yōu)化管理2降低了微生物代謝活性，抑制了微生物的生長，不利于各種類微生物的均衡發(fā)展。在本試驗條件下，將450 kg·hm-2復(fù)合肥、75 kg·hm-2緩釋肥、42.5 kg·hm-2KCl和197.5 kg·hm-2Ca(H2PO4)2一起作為基肥施入稻田，分蘗期時施入150 kg·hm-2尿素，孕穗期時施入300 kg·hm-2復(fù)合肥的氮肥管理模式更利于實現(xiàn)稻田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的穩(wěn)定發(fā)展，該結(jié)果可為當?shù)鼗蕼p施提供一定的理論基礎(chǔ)。