石兆勇，李 珂，王發(fā)園，王旭剛，徐曉峰

(1.河南科技大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，河南 洛陽 471003； 2.青島科技大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，山東 青島 266042)

隨著納米技術(shù)的快速發(fā)展，納米材料被廣泛應(yīng)用于人類的生產(chǎn)生活中，并發(fā)揮著不可替代的重要作用[1]。而納米材料在廣泛應(yīng)用的同時，不可避免地進入到了環(huán)境中，由此引發(fā)的潛在環(huán)境風(fēng)險問題已受到全世界的關(guān)注[2-3]。粒徑小、比表面積大的特性使納米顆粒極易吸附固定在土壤顆粒表面，并在土壤中發(fā)生遷移、轉(zhuǎn)化、溶解、沉淀、分散、聚集和氧化還原等一系列的復(fù)雜反應(yīng)[4-5]；從而影響植物的生長發(fā)育，并能被植物吸收，進入食物鏈，而引發(fā)健康風(fēng)險。因此，納米材料對植物的生物毒性效應(yīng)受到廣泛關(guān)注[6-7]。

納米銀因其特殊的抗菌特性及催化、超導(dǎo)性能，已成為應(yīng)用較為廣泛的納米材料[8]，納米銀的毒性效應(yīng)也得到了廣泛關(guān)注。研究表明，納米銀對黑麥草存在生物毒性，在低濃度下就會對種子萌發(fā)、生理生化及營養(yǎng)生長等起到抑制作用[9]。40 mg·L-1的納米銀抑制黑麥草根毛的形成，并破壞根的表皮、皮層與根冠等組織[10]。當(dāng)培養(yǎng)溶液中納米銀濃度為10 mg·L-1時，顯著降低了供試植物Spirodelapolyrhiza的生物量、葉綠素a含量、葉綠素a/b，以及PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/Fm)[11]。因此，納米銀在土壤-植物系統(tǒng)的歸趨、轉(zhuǎn)化和毒性值得重視[12]。

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi， AMF)作為與植物關(guān)系最為密切的一類共生微生物，能夠與陸地上80%的植物形成互惠共生關(guān)系，在改善植物抗逆和抗病方面發(fā)揮著重要作用[13-15]。AMF的菌絲對重金屬存在一定的吸附作用，通過分泌球囊霉素土壤蛋白等螯合重金屬，避免過量的重金屬進入植物體內(nèi)引發(fā)毒害[16-17]。研究表明，接種AMF顯著緩解了納米氧化鋅引起的負(fù)面影響，促進植物的生長和營養(yǎng)元素的吸收，增加光合色素含量和SOD活性，并減少活性氧的積累[18]。在對三葉草的研究中，也發(fā)現(xiàn)納米FeO和納米銀影響到AMF的侵染和促生效應(yīng)，且隨納米銀濃度的增加，AMF緩解納米銀脅迫的能力也逐漸增強，顯著降低了植物中銀含量和抗氧化酶活性[19]。叢枝菌根侵染率隨納米銀濃度增加而下降，而菌根侵染緩解了納米銀對植物的毒性，并且也減少了植物組織中積累的銀含量[20]。這些研究表明，納米銀在一定劑量時會抑制植物生長，而AMF可通過多種機制緩解納米銀的毒性。植物的生長與其光合生理特性密切相關(guān)，但關(guān)于納米銀和AMF共同作用對植物光合生理特性的影響還未見報道。本文以甜高粱為供試材料，探討了納米銀和叢枝菌根對其葉綠素?zé)晒馓匦缘挠绊?，以期揭示叢枝菌根緩解納米銀毒害的機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物為甜高梁[Sorghumbicolor(L.)Moench]，品種為雅津2號。供試AMF為GlomusetunicatumBEG168 (G.e)，培養(yǎng)的宿主植物為玉米、高粱等，培養(yǎng)基質(zhì)為河沙，去掉植物地上部分，剪碎根段，與根系土壤混合作為菌劑接種物。納米銀顆粒純度為99.9%，平均粒徑為40 nm。供試土壤取自河南科技大學(xué)農(nóng)場，過2 mm篩，風(fēng)干備用。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)置0、0.1、1和10 mg·kg-14個納米銀濃度水平，每個納米銀水平下設(shè)置接菌、不接菌，試驗共8個處理，每個處理重復(fù)4次。選用塑料花盆，每盆裝1.5 kg風(fēng)干土樣，采用逐級混勻的方法加入納米銀顆粒，接菌處理每盆加入100 g菌劑，不接菌處理加入等量滅菌菌劑。2017年4月26日播種，每盆均勻播種10顆甜高粱種子，出苗后每盆定苗6株，在日光培養(yǎng)室中培養(yǎng)，平均溫度為白天30 ℃，夜間溫度為22 ℃，植物生長期間精細(xì)管理，進行定期澆水通風(fēng)，稱重法使土壤含水量保持在70%左右，并定期隨機調(diào)整各盆位置，甜高粱生長90 d后收獲植株。

1.3 測定項目與方法

甜高粱收獲時將地上部分與根系部分分開收獲，收獲后用蒸餾水沖洗干凈，選取新鮮細(xì)根段，用KOH溶液脫色后，醋酸墨水染色，將根段剪成1 cm的小段置于載玻片上在顯微鏡下觀察，參考Trouvelot等[21]方法測定并計算根系菌根侵染率(F)、根系菌根侵染密度(M)、侵染根段菌根侵染密度(m)、侵染根段叢枝豐富度(a)、根系叢枝豐富度(A)。甜高粱生長40 d時，每盆隨機選取3株并對葉片相同部位經(jīng)暗適應(yīng)20 min后，采用M-PEA(Hansatech，UK)，在光照強度為飽和脈沖光(12 000 μmol·m-2·s-1)條件下，在1 s內(nèi)，測定OJIP曲線及其相關(guān)參數(shù)[22]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，Duncan多重比較各處理之間的差異顯著性(P<0.05)，雙因素方差分析納米銀施加水平和接種AMF之間的交互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同納米銀水平處理對叢枝菌根侵染率的影響

由表1可知，與未施加納米銀相比，施加納米銀顯著抑制了外源叢枝菌根的M、m、a和A，當(dāng)納米銀為1 mg·kg-1時根系菌根侵染率最低，但各處理各濃度間均無顯著性差異。在未接種外源叢枝菌根菌劑的條件下，甜高粱根系也可被叢枝菌根侵染，表明所選供試土壤中存在土著叢枝菌根且能夠侵染根系，而納米銀的施加對土著叢枝菌根無顯著影響。

2.2 叢枝菌根真菌對不同水平納米銀處理甜高粱葉片OJIP-test參數(shù)的影響

圖1顯示，不同濃度納米銀和接種叢枝菌根真菌處理對甜高粱初始熒光(Fo)、最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、PSⅡ潛在活性(Fv/Fo)和光合性能指數(shù)(PIabs)的影響狀況。結(jié)果表明，在所有4個納米銀濃度處理中，接種叢枝菌根真菌僅在1 mg·kg-1納米銀濃度處理下，顯著降低了甜高粱葉片F(xiàn)o值(圖1-A)；而接種叢枝菌根真菌對不同納米銀濃度處理下的Fv/Fm、Fv/Fo和PIabs則沒有顯著影響(圖1-B，C，D)。

接種叢枝菌根與納米銀對Fo、Fv/Fm、Fv/Fo和PIabs的共同影響表明，除Fo值以在1 mg·kg-1納米銀條件下不接種叢枝菌根真菌最高外，其他3個指標(biāo)的最高值均出現(xiàn)在0 mg·kg-1納米銀與接種叢枝菌根真菌處理中。

隨著納米銀濃度的增加，接菌處理Fo呈現(xiàn)增加的趨勢，而對照除在0、0.1和1 mg·kg-1納米銀處理下，也呈現(xiàn)增加的趨勢(圖1-A)。Fv/Fm、Fv/Fo和PIabs的變化來看，接種菌根處理，隨納米銀濃度的變化規(guī)律一致，都是逐步降低(圖1-B，C，D)；但不接種處理中，除在10 mg·kg-1濃度下，F(xiàn)v/Fm和Fv/Fo的值略高于1 mg·kg-1濃度處理外，其他3個處理也隨納米銀濃度的增加而降低；PIabs值則隨納米銀濃度的增加呈現(xiàn)出降低的趨勢。

表1 不同納米銀水平處理叢枝菌根侵染率Table 1 Effect of different concentrations of nano-silver on arbuscular mycorrhizal infection rates of sweet sorghum

同列數(shù)據(jù)后不同字母表示各處理在P<0.05水平差異顯著，下同。
Values with different lowercase letters in the same column represented statistically significant (P<0.05) differences among treatments. The same as below.

M，接菌；N，不接菌。圖中柱子上方?jīng)]有相同字母表示差異達顯著水平(P<0.05)。M， AMF treatment; N， Control. Different lowercase letters above the columns represented statistically significant (P<0.05) differences among treatments.圖1 不同處理對甜高粱Fo(A)、Fv/Fm(B)、Fv/Fo(C)和PIabs(D)的影響Fig.1 Effect of different nano-silver concentrations on Fo(A)， Fv/Fm(B)， Fv/Fo(C) and PIabs(D) of sweet sorghum under different treatments

2.3 叢枝菌根對不同水平納米銀處理甜高粱葉片比活性參數(shù)的影響

叢枝菌根和納米銀對甜高粱葉片比活性參數(shù)的影響狀況列于表2。不同濃度納米銀條件下，接種叢枝菌根后甜高粱葉片比活性參數(shù)的8個指標(biāo)均在1 mg·kg-1下，叢枝菌根處理顯著降低了ABS/CSo、DIo/CSo、TRo/CSo和ETo/CSo的值，而對ABS/RC、DIo/CSo、TRo/RC和ETo/RC則無顯著影響。

從所有接種叢枝菌根和納米銀的8個處理來看，ABS/RC、DIo/CSo和TRo/RC的最大值，均出現(xiàn)于10 mg·kg-1納米銀的接菌處理，而ABS/CSo、DIo/CSo、TRo/CSo和ETo/CSo的最大值則都出現(xiàn)在不接種叢枝菌根的1 mg·kg-1處理。

進一步分析菌根和納米銀的雙因素影響，表明菌根處理對ABS/CSo、DIo/CSo、TRo/CSo和ETo/CSo存在顯著的影響，而納米銀則對ABS/RC、DIo/RC、ABS/CSo、DIo/CSo和TRo/CSo這5個指標(biāo)具有明顯的影響；所測定的8個指標(biāo)都沒有受到菌根和納米銀交互作用的影響。

2.4 叢枝菌根真菌對不同水平納米銀處理甜高粱葉片Wk、OEC、Ψo和ΨEo的影響

Wk和OEC能反映PSⅡ供體側(cè)的變化，而ψo和ΨEo能反映PSⅡ受體測光能轉(zhuǎn)化效率的變化[23]。因此，研究了接種叢枝菌根真菌和納米銀共同處理條件下，甜高粱葉片Wk、OEC、Ψo和ΨEo受影響的狀況(圖2)。Wk和OEC對接種菌根的反應(yīng)恰恰相反，接種處理分別隨著納米銀濃度的增加，呈現(xiàn)出增加和降低的趨勢(圖2-a，b)。對于Ψo而言，隨著納米銀濃度的增加而逐漸降低，但不接菌處理始終高于接菌處理(圖2-c)。ΨEo的結(jié)果則表明，在所有處理中，接種菌根處理均能被很大程度地提高；且在接菌條件下，ΨEo隨納米銀濃度的增加而逐漸增大；對于不接菌對照處理而言，除無納米銀處理外，也隨納米銀濃度的增加而增加(圖2-d)。

表2 不同處理對甜高粱葉片比活性參數(shù)的影響Table 2 Effect of different nano-silver concentrations on leaf activity parameters of sweet sorghum under different treatments

表中數(shù)據(jù)為不同納米銀濃度處理的參數(shù)均是與0 mg·kg-1納米銀且不接種AMF處理的比值；雙因素方差分析結(jié)果為F值，*表示P<0.05，**表示P<0.01。
The data under different nano-silver concentration were the ratio between measured value and value in non-AMF and 0 mg·kg-1nano-silver concentration. The results of two-factors ANOVA were represented byFvalue. *， ** afterFvalue meaned statistically significant atP<0.05，P<0.01， respectively.

圖2 不同處理下對甜高粱Wk、OEC、Ψo和ΨEo的影響Fig.2 Effect of different nano-silver concentrations on Wk， OEC， Ψo and ΨEo of sweet sorghum under different treatments

3 討論

納米銀對外源接種的AMF有一定毒性，抑制了菌根侵染植物根系，表現(xiàn)出菌根毒性效應(yīng)(表1)，這一結(jié)果支持了以往的研究結(jié)論，如研究表明，施加銀和鈦納米顆粒能降低接種Glomusintraradices對向日葵菌根侵染率的45%[23]。Judy等[24]研究了不同濃度硫化銀和聚乙烯吡咯烷酮包裹的Ag-NPs對番茄菌根侵染的影響，表明PVP-Ag濃度為100 mg·kg-1時，菌根侵染率明顯降低，而對土著AMF侵染卻沒有顯著的抑制作用；這一點與本研究的結(jié)果非常類似。

植物葉綠素?zé)晒鈪?shù)能敏感地反映植物光合作用受環(huán)境脅迫的情況[25]。Fv/Fm下降，表明 PSⅡ反應(yīng)中心最大光能轉(zhuǎn)換效率下降，電子傳遞量減少，出現(xiàn)光抑制，植物體內(nèi)過剩光能就可能對光合機構(gòu)造成損傷[26]。本研究結(jié)果顯示，納米銀的施加降低了Fv/Fm、Fv/Fo和PIabs的值，同時伴隨Fo的升高，表明隨施加納米銀濃度的增加，可能導(dǎo)致PSⅡ的傷害程度增加，這與上面所報道的研究結(jié)論一致。在一些研究中也得到了證實，如胡文海等[27]對2種辣椒的干旱脅迫的研究就表明，葉片F(xiàn)o在干旱脅迫下均升高；孫璐等[28]對高粱鹽脅迫下的研究也表明，隨鹽脅迫的加重，F(xiàn)o也逐漸增加。從相同濃度納米銀處理的接菌和對照Fo、Fv/Fm和Fv/Fo的結(jié)果來看，除了在10 mg·kg-1處理中，接種處理均能保護PSⅡ。而在本研究中，無外源接種AMF條件下，1 mg·kg-1納米銀施加濃度處理顯著增加了Fo值，且高于10 mg·kg-1濃度納米銀的處理，以及Fv/Fm和Fv/Fo在10 mg·kg-1時，菌根處理略低于對照的現(xiàn)象，可能與納米銀的毒害機制或特性有關(guān)，因為研究表明，高濃度的納米銀具有團聚作用，從而使釋放出的銀離子濃度降低，對植物的毒性也有所降低[19]。

納米銀和叢枝菌根共同處理對電子傳遞鏈供受體側(cè)參數(shù)Wk、OEC、Ψo和ΨEo的結(jié)果表明，隨納米銀濃度的增加，電子傳遞鏈供體側(cè)受到的傷害可能逐漸升高(圖2-a，b)，這與已有的報道一致，如李旭新等[29]在研究NaCl脅迫時，就表明OEC降低和Wk值升高，進一步表明電子在PSⅡ供體側(cè)的傳遞受阻，PSⅡ被破壞的程度增強。從電子傳遞鏈的受體測參數(shù)Ψo和ΨEo來看，Ψo的結(jié)果表明，隨納米銀濃度的增加，電子傳遞鏈?zhǔn)荏w側(cè)受到的損害程度也呈增加趨勢，導(dǎo)致其接收到的電子減少，但從ΨEo的結(jié)果來看，其傳遞電子的數(shù)量反而有所增加，這一結(jié)果與以往的研究結(jié)果以及與Ψo的趨勢看似矛盾，但若結(jié)合外源菌根接種處理進行分析，就會發(fā)現(xiàn)在接菌處理，電子受體側(cè)指標(biāo)Ψo相對于不接菌對照更低，這可能與叢枝菌根能夠幫助寄主植物吸收更多的礦質(zhì)元素有關(guān)，可能在低濃度納米銀(0.1和1 mg·kg-1)條件下，外源叢枝菌根不能識別納米銀的毒害，導(dǎo)致大量吸收納米銀所致；而在高濃度(10 mg·kg-1)時，可能由于納米銀的團聚作用[19]，同樣降低了毒性，而加入了叢枝菌根致使其吸收量增加，從而出現(xiàn)了Ψo在接種菌根處理更低的結(jié)果。當(dāng)考慮ΨEo時，可以看出在不接菌的4個處理中，其變化較小，而接菌處理較高，且隨納米銀濃度的增加，變化較大，這可能是由于叢枝菌根在吸收納米銀的同時，也吸收了一些有利于緩解納米銀脅迫的礦質(zhì)元素，從而導(dǎo)致了納米銀的脅迫有所緩解，而致使ΨEo有所增加；因為植物干旱脅迫條件下，施加Si元素也能顯著提高ΨEo值[30]，而關(guān)于接種叢枝菌根提高植物對各類礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收、轉(zhuǎn)運和分配已經(jīng)被證實[31-32]。當(dāng)然，也有可能是其他原因造成的，有待進一步探討。

甜高粱葉片比活性參數(shù)DIo/RC和DIo/CSo在納米銀施加后均增加，表明熱耗散機制被啟動，可以防御過剩激發(fā)能的增加，這可能是植物對納米銀傷害的一種防御機制。然而，ABS/RC和ABS/CSo的結(jié)果表明，納米銀對比PSⅡ反應(yīng)中心仍造成了傷害，降低了PSⅡ的光能效率。從參數(shù)TRo/CSo和ETo/CSo來看，二者呈現(xiàn)相同的規(guī)律，都是在1 mg·kg-1濃度下，菌根效應(yīng)顯著，而在其他納米銀濃度下則無效應(yīng)，這可能是在1 mg·kg-1的納米銀濃度下，接種叢枝菌根真菌而導(dǎo)致了植物所受到傷害更大，這可能是在該濃度條件下，叢枝菌根真菌沒有識別納米銀為污染物所導(dǎo)致的；這一結(jié)果與電子傳遞鏈的受體測參數(shù)Ψo的結(jié)果是一致的；但總體來看與ΨEo的結(jié)果呈現(xiàn)出矛盾的趨勢，這有待進一步探討。

綜上所述，納米銀對外源AMF有一定毒性，抑制菌根侵染植物根系。隨納米銀施加濃度增加，造成PSⅡ受到傷害，而接種外源叢枝菌根能在一定程度上緩解納米銀的毒害，但其機制有待進一步探討。