顏珊珊 邵亞洲 梁俊玉

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 甘肅蘭州 730070）

職業(yè)院校是我國(guó)人才培養(yǎng)的重要組成部分，以培養(yǎng)符合社會(huì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展需要的專業(yè)技能人才為己任。目前，我國(guó)處于經(jīng)濟(jì)上升時(shí)期，需要大批具有創(chuàng)新、創(chuàng)業(yè)能力的人才，這就要求職業(yè)院校在人才培養(yǎng)過(guò)程中要將創(chuàng)新、實(shí)踐實(shí)訓(xùn)能力和應(yīng)用能力等作為培養(yǎng)的主要目標(biāo)［1］。實(shí)驗(yàn)教學(xué)是職業(yè)院校生物學(xué)教學(xué)的重要環(huán)節(jié),學(xué)生可通過(guò)實(shí)驗(yàn)親身操作、主動(dòng)發(fā)現(xiàn)，從而尋求自身的主動(dòng)發(fā)展，提高實(shí)驗(yàn)操作技能和促進(jìn)思維的多向發(fā)展［2］。

黃芪為豆科多年生草本植物膜莢黃芪［As tragalus membranaceus（Fisch.Bge.）和蒙古黃芪(Astragalus membraneceus（Fisch.Bge.）var.monghlicus（Bge.） Hsiao］的干燥根，具有補(bǔ)氣升陽(yáng)、益衛(wèi)固表之功效，古有“補(bǔ)藥之長(zhǎng)”之稱。黃酮類物質(zhì)作為中藥黃芪的主要有效成分。近年來(lái)，對(duì)黃芪黃酮類物質(zhì)的研究主要集中在抗輻射損傷、清除氧自由基、調(diào)控離子通道蛋白、增強(qiáng)免疫、抗病毒等方面；對(duì)于細(xì)胞保護(hù)、心律失常性疾病、感染性疾病有很好的應(yīng)用前景［3］。目前實(shí)驗(yàn)室對(duì)黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的測(cè)定方法主要包括紅外光譜法、薄層色譜法、高效液相色譜法。本次教學(xué)主要以甘肅省隴西縣本地黃芪為原材料,將黃芪黃酮類毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)作為職業(yè)院校生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的內(nèi)容進(jìn)行嘗試,證實(shí)黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的各環(huán)節(jié)均具有可控性,學(xué)生可順利完成實(shí)驗(yàn)并得到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利于實(shí)驗(yàn)課堂教學(xué)目標(biāo)的有效達(dá)成。

1 黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)

1.1 教學(xué)目標(biāo)

1）知識(shí)目標(biāo)：①通過(guò)收集與查閱相關(guān)資料，對(duì)中草藥黃芪和黃酮類物質(zhì)的藥用價(jià)值產(chǎn)生濃厚的學(xué)習(xí)興趣，并認(rèn)識(shí)到黃酮類物質(zhì)的研究?jī)r(jià)值。②掌握黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定的基本步驟，明確實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和注意事項(xiàng)。

2）能力目標(biāo)：①學(xué)會(huì)高效液相色譜（HPLCELSD）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀等實(shí)驗(yàn)設(shè)備的使用及注意事項(xiàng)。②學(xué)會(huì)組裝回流裝置，并能說(shuō)出搭建回流裝置的原理。③能獨(dú)自制作黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算黃芪藥材中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量。

3）情感態(tài)度與價(jià)值觀目標(biāo)：認(rèn)識(shí)到中草藥黃芪和黃酮類物質(zhì)的藥用價(jià)值及研究前景,加深對(duì)中藥材的學(xué)習(xí)興趣。

1.2 實(shí)驗(yàn)教學(xué)活動(dòng)組織 實(shí)驗(yàn)前，學(xué)生主動(dòng)收集并查閱中藥材黃芪和黃酮類物質(zhì)的相關(guān)資料，教師制定實(shí)驗(yàn)方案并對(duì)全班進(jìn)行分組,采用小組合作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)教學(xué)。學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)基本步驟有了初步了解。實(shí)驗(yàn)教學(xué)活動(dòng)中，每組成員必須全部參與到活動(dòng)中，親自操作，互學(xué)互助。教師在旁引導(dǎo)，啟發(fā)學(xué)生思考，主動(dòng)發(fā)現(xiàn)、解決問(wèn)題。實(shí)驗(yàn)教學(xué)活動(dòng)結(jié)束后，各組匯報(bào)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行小組討論，思考實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的注意事項(xiàng)與易錯(cuò)環(huán)節(jié)，合作交流，共同進(jìn)步，最后教師進(jìn)行總結(jié)。

1.3 實(shí)驗(yàn)教學(xué)安排

1.3.1 材料與儀器

1）試劑與儀器。①試劑：黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（純度為95%）、色譜純乙腈和甲醇、分析純甲醇、超純水、0.2%甲酸溶液。②儀器：4 號(hào)篩子、圓底燒瓶、冷凝管、25 mL 大肚移液管、高效液相色譜儀、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、水浴鍋、粉碎機(jī)。

2）材料準(zhǔn)備。選用甘肅省隴西縣黃芪，依據(jù)黃芪根部的大小，分為粗、細(xì)及混合樣品。取適量黃芪，置于50℃的恒溫烘箱中，除去水分（直至烘干前后質(zhì)量相差不到0.1 g）。用粉碎機(jī)將黃芪粉碎，過(guò)4 號(hào)篩子，備用。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)操作步驟與流程［4］

1）色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；色譜乙腈為流動(dòng)相A，0.2%甲酸溶液為流動(dòng)相B。按下表中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm，紫外檢測(cè)器檢測(cè)。

表1 黃芪黃酮中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定

2）對(duì)照品溶液的制備：取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每l mL 含50 μg 的溶液，即得。

3）供試品溶液的制備：取本品粉末（過(guò)4 號(hào)篩）約l g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定質(zhì)量。加熱回流4 h，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量。搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙?，轉(zhuǎn)移至5 mL 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

4）測(cè)定法：分別精密吸取對(duì)照品溶液，供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀。

5）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：分別精密量取毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品貯備液適量,用分析純甲醇制備成系列濃度梯度,按照上述色譜條件分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定。以峰面積值（y）為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。黃芪黃酮中毛蕊異黃酮葡萄糖苷回歸方程為：y=0.9159x-3.3246（R2=0.999）。

1.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

1.4.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定對(duì)實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范程度并不苛刻,只要學(xué)生按照教師的要求嚴(yán)格操作,一般都能得到較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

本次實(shí)驗(yàn)中，全班共24 人，分成3 組。3 個(gè)小組分別根據(jù)黃芪根部大小進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，即分別以黃芪粗、細(xì)和混合樣品為材料，測(cè)其毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量。3 個(gè)小組都得到了較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖1），1 組選擇以黃芪粗粉為原材料，上樣后發(fā)現(xiàn)黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷出峰時(shí)間為6.5 min 左右，色譜峰分離效果明顯，無(wú)平峰，皆為單峰且峰型尖銳，呈對(duì)稱狀。該HPLC 圖譜說(shuō)明整個(gè)實(shí)驗(yàn)流程中未出現(xiàn)雜質(zhì)干擾，學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作得當(dāng)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)無(wú)論黃芪根部粗細(xì)如何,其毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量皆在0.07%左右，且細(xì)粉中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量略低于黃芪粗粉和混合粉（表2），說(shuō)明黃芪根部粗細(xì)對(duì)毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的測(cè)定結(jié)果影響不大,即最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示甘肅隴西縣本地黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量為0.073%。

圖1 甘肅隴西縣本地黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷的HPLC 圖

表2 甘肅隴西縣本地黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量

1.4.2 實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

1)毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品溶液必須在48 h內(nèi)使用，遵守現(xiàn)配現(xiàn)用原則。

2）涉及到“精密稱定”“精密量取”字樣時(shí)，要分別使用精確到4 位數(shù)的電子天平和大肚移液管。

3）在供試劑準(zhǔn)備過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)保留續(xù)慮液，這里的“續(xù)濾液”指的是液體過(guò)濾時(shí)，開(kāi)始濾過(guò)的部分液體選擇棄去，余下濾液稱為續(xù)濾液。

2 實(shí)驗(yàn)教學(xué)活動(dòng)總結(jié)與反思

職業(yè)院校以培養(yǎng)技術(shù)技能人才為己任,著重培養(yǎng)學(xué)生操作動(dòng)手能力。對(duì)此，教師應(yīng)選擇合理的教學(xué)方式，因材施教，采用多種方式激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)興趣。

1）貫徹“以學(xué)生為主體，教師引導(dǎo)”的教學(xué)方式，進(jìn)行啟發(fā)式教學(xué)。實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中，教師要始終將學(xué)生放在主體地位，讓學(xué)生自主交流，自主思考，主動(dòng)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，思考解決問(wèn)題的辦法。教師在旁觀察學(xué)生，在恰當(dāng)時(shí)刻引導(dǎo)學(xué)生，啟發(fā)學(xué)生，而非對(duì)學(xué)生進(jìn)行“填鴨式”教學(xué)，禁錮學(xué)生思維的多向發(fā)展。

2）采用合作學(xué)習(xí)教學(xué)策略，培養(yǎng)學(xué)生發(fā)現(xiàn)問(wèn)題、分析問(wèn)題、解決問(wèn)題能力。黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷測(cè)定實(shí)驗(yàn)簡(jiǎn)單，操作少，但同樣離不開(kāi)小組成員的相互合作，例如黃芪樣品的制備，高效液相流動(dòng)相的配制等需要小組成員的分工合作。同時(shí)，教師要鼓勵(lì)小組成員全體參與到實(shí)驗(yàn)中，體驗(yàn)參與實(shí)驗(yàn)的樂(lè)趣。在合作學(xué)習(xí)過(guò)程中，小組成員積極思考，親自操作，主動(dòng)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，共同思考解決問(wèn)題的方式。

3）采取實(shí)驗(yàn)室教學(xué)，培養(yǎng)學(xué)生生物科學(xué)素養(yǎng)。在實(shí)驗(yàn)教學(xué)過(guò)程中,學(xué)生可直接觀察中藥材黃芪的形態(tài)特征，認(rèn)識(shí)到黃芪的研究?jī)r(jià)值，明確實(shí)驗(yàn)教學(xué)的教學(xué)目標(biāo)與小組任務(wù)。同時(shí)，采取實(shí)驗(yàn)教學(xué)的方式，學(xué)生可在活動(dòng)中親身實(shí)踐，鍛煉自身實(shí)驗(yàn)操作能力，培養(yǎng)生物科學(xué)素養(yǎng)。