林先鋒 陳思達 張興明 林麗萍 張鳳英**

（1 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 江西南昌 330045 2 江西省食品檢驗檢測研究院 江西南昌 330045）

土豆塊莖中約含淀粉15～25%，蛋白質(zhì)2～3%，脂肪0.7%，粗纖維0.15%，還含有豐富的鈣、磷、鐵、鉀等礦物質(zhì)，以及VC、VA 和B 族維生素，營養(yǎng)豐富［1-2］。土豆葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（簡稱PDA）是一種以土豆為主要原料的半合成培養(yǎng)基,常用于真菌的培養(yǎng)［3］。由于現(xiàn)配PDA 需經(jīng)過購買土豆、洗凈、切片和煮制等較繁瑣的過程，相關(guān)企業(yè)開發(fā)了商品化速成PDA 培養(yǎng)基，只需稱量加水融化即可，簡單方便快捷。但在使用PDA 進行傳代、活化和轉(zhuǎn)接培養(yǎng)菌種的過程中,發(fā)現(xiàn)用當(dāng)季和過季土豆制備的PDA 培養(yǎng)青霉、黑曲霉和根霉等常見霉菌菌株時，它們的長勢有明顯差別，現(xiàn)配PDA 與商品化速成PDA 的效果也有所不同。例如，在使用商品化速成PDA 培養(yǎng)桔青霉時，發(fā)現(xiàn)不僅菌絲生長緩慢,而且培養(yǎng)4～5 d 都不長孢子或孢子很少；用于轉(zhuǎn)接曲霉、根霉菌體生長狀況也不理想。鑒于目前未見任何有關(guān)現(xiàn)配PDA 與商品化速成PDA 應(yīng)用效果方面的報道，本文對幾種霉菌在現(xiàn)配PDA 與商品化速成PDA 上的生長、產(chǎn)孢子量及胞外酶活力進行了比較研究。

本文以米根霉2-2、黑曲霉柚-1 和酒精酵母Sa2 為實驗菌株,通過比較各菌株分別在當(dāng)季土豆現(xiàn)配PDA、過季土豆現(xiàn)配PDA 和商品化速成PDA 上的生長情況、胞外酶活力及應(yīng)用效果，確定商品化速成PDA 的應(yīng)用范圍和應(yīng)用價值。以期為從事相關(guān)研究的科研工作者在選擇PDA 培養(yǎng)基時提供參考,針對所培養(yǎng)菌株的用途選擇配制方法簡便有效的PDA 培養(yǎng)基。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 黑曲霉柚-1（Aspergillus niger）、米根霉2-2（Rhizopus oryzae）和釀酒酵母Sa2（Saccharomyces cerevisiae），均由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實驗室提供。

1.1.2 原料 市售當(dāng)季土豆、過季土豆、豆芽及糯米；福建平和琯溪蜜柚皮，購自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園水果店。

1.1.3 藥品及主要儀器 商品化速成PDA 培養(yǎng)基粉（南昌醫(yī)藥公司），分析純無水葡萄糖、冰醋酸及醋酸鈉，生物試劑DNS 溶液，食品級羧甲基纖維素（CMC），定性濾紙。

SPX-450 智能生化培養(yǎng)箱（上海谷寧儀器有限公司），GZX-DH 電熱恒溫干燥箱（上海躍進醫(yī)療器械廠），DSX-280 手提式壓力滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 當(dāng)季PDA 培養(yǎng)基（APDA）：稱取200 g 當(dāng)季土豆，洗凈去皮切成小塊，加水1 000 mL 煮沸，20 min；紗布過濾，濾液加水補足1 000 mL，再加入20 g 葡萄糖及20 g 瓊脂，加熱使其充分溶解；分裝，121℃滅菌20 min。

過季PDA 培養(yǎng)基（BPDA）：稱取200 g 過季土豆，洗凈去皮切成小塊，其余操作同APDA。

商品化速成PDA 培養(yǎng)基（CPDA）：稱取商品PDA 粉46.0 g，加入1 000 mL 蒸餾水，115℃高壓滅菌20 min。

液體APDA：同固體APDA，不加瓊脂。

液體BPDA：同固體BPDA，不加瓊脂。

豆芽汁培養(yǎng)基：稱取200 g 新鮮豆芽，洗凈，切碎，加水1 000 mL，煮沸20 min；紗布過濾，濾液加水補足1 000 mL，再加入200 g 葡萄糖，加熱使其充分溶解，分裝三角瓶，121℃滅菌20 min。

1.2.2 3 種PDA 對幾種霉菌形態(tài)的影響 用接種環(huán)分別挑取3～5 環(huán)黑曲霉或米根霉斜面菌體接入5 mL 無菌水中，振蕩搖勻，制成孢子懸液。分別取幾微升孢子懸液點接在各PDA 平板中間，30℃恒溫培養(yǎng)24～72 h，觀察霉菌的菌絲直徑、孢子穗或孢子囊大小、菌落直徑和菌落形態(tài)等［4］。

1.2.3 酵母菌在當(dāng)季和過季液體PDA 的生長情況 用接種環(huán)挑取3～5 環(huán)斜面酵母菌接入5 mL無菌水中，振蕩搖勻，制成菌懸液。用無菌移液管分別吸取1 mL 酵母菌懸液至100 mL 當(dāng)季液體PDA 和過季液體PDA 中,每組3 個平行，30℃恒溫培養(yǎng)16 h，檢測酵母菌大小和數(shù)量。

1.2.4 酵母菌對乙醇發(fā)酵的影響 用無菌移液管分別吸取5 mL 2 種液體PDA 酵母菌培養(yǎng)液至100 mL 豆芽汁培養(yǎng)基中，搖勻，30℃恒溫培養(yǎng)4～5 d，直至豆芽汁培養(yǎng)液中的氣泡消失，用蒸餾法測定發(fā)酵液的酒度。

1.2.5 黑曲霉分解柚子皮能力粗測［5］挑取3 種PDA 斜面培養(yǎng)的黑曲霉接入3 mL 無菌水中，振蕩搖勻，制成孢子懸液備用。稱取10 g 新鮮柚子皮，切塊，放入培養(yǎng)皿中，接入適量黑曲霉孢子懸液，30℃恒溫培養(yǎng)4～6 d，將長滿黑孢子的柚子皮取出，用清水將表面的菌體及分解物沖洗干凈，放入56～60℃烘箱內(nèi)烘干至恒重后稱重（記為M）。同時，將10 g 新鮮柚子皮（不接種孢子懸液）放入烘箱內(nèi)干燥至恒重（記為M0）。計算黑曲霉對柚子皮的分解率（%）=×100%。再用光學(xué)顯微鏡觀察柚子皮分解前、后的顯微結(jié)構(gòu)。

1.2.6 米根霉PDA 斜面培養(yǎng)物的糖化力測定［6］挑取3 種PDA 斜面培養(yǎng)的米根霉菌體放入5 mL 無菌水中，振蕩搖勻，制成孢子懸液備用。稱取糯米100 g 用紗布包好,浸泡4 h 左右放入鍋中隔水蒸至米粒透明無白心。待糯米蒸熟冷卻后，放入杯中。將上述孢子懸液均勻淋入糯米飯中，再加入55 mL 純凈水，保鮮膜封口，30℃恒溫發(fā)酵1.5～2 d，測發(fā)酵液的糖化力和液化力，根霉的糖化力用發(fā)酵液的糖度表示,液化力用壓榨出發(fā)酵液的體積數(shù)表示；同時品嘗發(fā)酵液的口味。

1.2.7 發(fā)酵液的糖度測量 用手持式糖度計測定發(fā)酵液的糖度。

1.2.8 米根霉胞外糖化酶活力的測定 用斐林滴定法［7］測定米根霉胞外糖化酶的活力。

1.2.9 纖維素酶系活力測定

1.2.9.1 粗酶液的制備 在500 mL 錐形瓶中裝入24 g 柚子皮粉、1 g 麩皮和1 g 硫酸銨,用玻璃棒攪拌均勻，滅菌冷卻后加入16 mL 無菌水，搖勻打散，28℃恒溫培養(yǎng)60 h（培養(yǎng)期間搖晃4～5 次）。取適量發(fā)酵固體于錐形瓶中,加入50 倍蒸餾水，適當(dāng)攪拌后在40℃恒溫水浴鍋中浸提1 h。用濾紙過濾，濾液即為粗酶液。

1.2.9.2 3，5-二硝基水楊酸測定還原糖法檢測濾紙酶活和CMC 酶活 以CMC-Na 或濾紙為底物，加入1 mL 稀釋粗酶液和l mL pH=7.0 的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液于50℃水浴鍋中，保溫65 min，加入2 mL DNS 試劑停止反應(yīng)，再沸水浴煮沸10 min；冷卻后，于530 nm 處比色檢測CMC 酶活和 濾紙酶 活［8］。

2 結(jié)果與分析

2.1 霉菌和酒精酵母在不同PDA 上的生長狀況

2.1.1 黑曲霉生長狀況 不同時間內(nèi)，黑曲霉在3 種PDA 上的培養(yǎng)情況見表1。由表1可知，培養(yǎng)24 h 和48 h 時,黑曲霉在2 種現(xiàn)配PDA 上的菌落直徑比CPDA 更大，菌落蔓延范圍更廣，菌絲生長速度更快。培養(yǎng)72 h 時，APDA 的菌落直徑最大，CPDA 次之，BPDA 最小。

表1 不同時間黑曲霉的培養(yǎng)狀況

此外,培養(yǎng)48 h 后,APDA 上黑曲霉的孢子穗最大,達到了68.12 μm，菌絲稠密粗壯,達16.20 μm，產(chǎn)大量黑孢子，非常適合黑曲霉的生長。而BPDA和CPDA 上黑曲霉的孢子穗大小和菌絲粗細(xì)相差不大，都不及APDA 培養(yǎng)的效果理想。黑曲霉72 h培養(yǎng)效果見圖1（上）（本文附圖見封四）。由圖1很容易看出，72 h 后，2 種現(xiàn)配PDA 的培養(yǎng)效果比CPDA 更好，表現(xiàn)為菌絲濃密，產(chǎn)大量黑孢子；而CPDA 上黑孢子明顯更少，菌落小，菌叢低矮，邊緣有較大一圈白色菌絲，生長相對更為緩慢。

總體上看，黑曲霉在2 種現(xiàn)配PDA 上生長更旺盛，長速更快。

2.1.2 米根霉生長情況 米根霉在3 種PDA 的生長情況見表2。由表2可知，米根霉在2 種現(xiàn)配PDA 培養(yǎng)24 h 后菌落直徑較大、長勢較快，而在CPDA 上長勢較慢、菌落直徑較??；在APDA 上的菌絲稠密粗壯,有光澤,而在CPDA 上菌絲細(xì)小無光。

表2 米根霉的生長情況

培養(yǎng)48 h 后,米根霉均長滿平皿；在APDA上長勢最好，表現(xiàn)為：菌絲稠密粗壯，有光澤，產(chǎn)大量黑孢子，孢子囊較大。而在CPDA 上米根霉菌絲細(xì)小無光，黑孢子較少。其培養(yǎng)48 h 后效果見圖1（下）。以上結(jié)果說明，2 種現(xiàn)配PDA 對米根霉的生長繁殖更有利。

2.1.3 酵母菌在2 種液體PDA 的生長情況 就數(shù)量而言，酵母菌在液體BPDA 中培養(yǎng)16 h 后比液體APDA 中多，為6.16×107個／mL，而后者僅為4.62×107個／mL；從大小上看，液體APDA 中的酵母菌為5.73×8.80 μm，更接近球形，而液體BPDA中的酵母菌為5.27×9.07 μm,更接近長橢圓形，即液體APDA 培養(yǎng)的酵母菌粗壯一點,液體BPDA培養(yǎng)的酵母菌細(xì)長一點。從酵母數(shù)量上看,液體BPDA 比APDA 多1.46×107個／mL。

2.2 不同PDA 培養(yǎng)的霉菌和酵母的應(yīng)用效果

2.2.1 黑曲霉分解柚子皮能力的粗測 圖2（上）為黑曲霉在柚子皮上生長6 d 的效果。很明顯，APDA 組柚子皮上布滿黑孢子，BPDA 組柚子皮上基本布滿黑孢子,而CPDA 組柚子皮上僅一半?yún)^(qū)域長有黑孢子，說明2 種現(xiàn)配PDA 上的黑曲霉對柚子皮的利用率更高。

由表3可知，用2 種現(xiàn)配PDA 培養(yǎng)的黑曲霉對柚子皮的分解率分別為60.77%和54.70%，均比用CPDA 培養(yǎng)的黑曲霉對柚子皮的分解率更高,說明2 種現(xiàn)配PDA 更適合黑曲霉生長繁殖，產(chǎn)纖維素酶的活性更強。用APDA 培養(yǎng)的黑曲霉分解能力最強，對柚子皮的利用率最高，比BPDA高6.07%，比CPDA 高6.63%。

表3 黑曲霉分解柚子皮能力

柚子皮被3 種PDA 培養(yǎng)的黑曲霉分解前、后的顯微結(jié)構(gòu)見圖2（下）。顯而易見，原本致密的纖維結(jié)構(gòu)被不同PDA 培育的黑曲霉分解后的松散程度明顯不一樣,其中由現(xiàn)配PDA 培養(yǎng)的黑曲霉分解后的柚子皮纖維結(jié)構(gòu)的松散程度比CPDA 更高，這說明2 種現(xiàn)配PDA 培養(yǎng)的黑曲霉產(chǎn)纖維素酶活力更高，分解柚子皮纖維素能力更強，應(yīng)用效果更好。

2.2.2 3 種PDA 培養(yǎng)米根霉的應(yīng)用效果 PDA米根霉斜面培養(yǎng)物發(fā)酵糯米的糖化力和液化力見表4。由表4可知，用2 種現(xiàn)配PDA 培養(yǎng)的米根霉的糖化力和液化力,均比用CPDA 培養(yǎng)的米根霉的糖化力和液化力更高，說明現(xiàn)配PDA 更有利于米根霉分泌糖化酶，且其酶活力更高。就2 種現(xiàn)配PDA 來說，用APDA 培養(yǎng)的米根霉的液化力比用BPDA 培養(yǎng)的米根霉的液化力更高。

表4 米根霉和黑曲霉的胞外酶活

2.2.3 酵母菌對乙醇發(fā)酵的影響 從發(fā)酵液酒度分析,液體APDA 培養(yǎng)的酵母菌發(fā)酵的酒度為11.13 度，而用液體BPDA 培養(yǎng)的酵母菌發(fā)酵的酒度為10.73 度，前者比后者提高了3.73%。

總體分析,雖然酵母菌在液體BPDA 中培養(yǎng)16 h 后的數(shù)量更多,但其酒化酶活性不如APDA中培養(yǎng)的酵母菌，發(fā)酵能力較差。酵母數(shù)量多少與初始接入的酵母種細(xì)胞數(shù)量有一定關(guān)系；說明酒化酶活性與所培養(yǎng)的酵母的發(fā)酵能力關(guān)系較大，與酵母細(xì)胞數(shù)量關(guān)系較小。綜上可知，液體APDA培養(yǎng)的酵母菌的酒化酶活性較強。由此可見營養(yǎng)對酒精酵母發(fā)酵能力的重要性。

2.3 不同PDA 培養(yǎng)霉菌的胞外酶活力

2.3.1 米根霉胞外糖化酶活力 以米根霉孢子的麩皮培養(yǎng)物作為酒曲，檢測不同PDA 培養(yǎng)米根霉的胞外糖化酶活力，結(jié)果見表4。由表4可知，3 種PDA 培養(yǎng)的米根霉的胞外糖化酶活力大小排列次序為：APDA＞BPDA＞CPDA,與上面用于糖化糯米的結(jié)果一致。

2.3.2 黑曲霉的胞外纖維素酶活力 不同PDA培養(yǎng)的黑曲霉的胞外纖維素酶的濾紙酶活力和CMC 酶活力見表4。由表4可知，3 種PDA 培養(yǎng)的黑曲霉的胞外纖維素酶的CMC 酶活力大小排列 次 序 為：APDA ＞BPDA ＞CPDA，APDA 和BPDA的CMC 酶活力比CPDA 高23.2～40.7 U／mL；APDA與BPDA 的濾紙酶活相差不大,但比CPDA 要高8.1～8.7 U／mL。

3 結(jié)論與討論

用土豆現(xiàn)煮現(xiàn)配的PDA 培養(yǎng)生長的黑曲霉菌絲濃密粗壯，黑孢子多，生長速度快；在商品化速成PDA 上菌落小，菌叢低矮，黑孢子少，生長較緩慢?，F(xiàn)配PDA 培養(yǎng)的黑曲霉產(chǎn)胞外纖維素酶活力更高,現(xiàn)配PDA 的CMC 酶活比商品化速成PDA 高23.2～40.7 U／mL，濾紙酶活高8.1～8.7 U／mL，分解柚子皮纖維素能力更強，應(yīng)用效果更好。

米根霉在當(dāng)季土豆現(xiàn)配PDA 上長勢良好：菌絲稠密粗壯，有光澤，黑孢子多，孢子囊也較大。在商品化速成PDA 上生長速度不僅慢,而且菌絲纖細(xì)無光，黑孢子也更少、更小。2 種現(xiàn)配PDA 培養(yǎng)的米根霉產(chǎn)胞外糖化酶性能較好，且酶活更高。對于根霉菌來說，2 種現(xiàn)配PDA 應(yīng)用效果也更好。

用當(dāng)季液體PDA 培養(yǎng)的酒精酵母分泌的酒化酶活性更好，酒精發(fā)酵能力更強。

綜上所述：現(xiàn)配PDA 培養(yǎng)的根霉、黑曲霉和酒精酵母生產(chǎn)應(yīng)用性能明顯比商品化速成PDA 更優(yōu)越。當(dāng)季土豆現(xiàn)配PDA 由于營養(yǎng)成分豐富，非常適合霉菌的生長繁殖，有助于其產(chǎn)酶性能及生產(chǎn)應(yīng)用效果的穩(wěn)定；商品化速成PDA 雖然配制簡便快捷，但只適合做一般驗證實驗和生理生化實驗，不適合生產(chǎn)用菌株的活化、轉(zhuǎn)接培養(yǎng)。如果要應(yīng)用于生產(chǎn)，必須選用當(dāng)季土豆現(xiàn)配的PDA。

為何過季土豆PDA 和商品化速成PDA 培養(yǎng)的微生物長勢弱，應(yīng)用效果差？深究其原因應(yīng)該是二者營養(yǎng)價值比當(dāng)季土豆要差,因為許多營養(yǎng)成分有半衰期，例如，磷的半衰期為14 d、鐵的半衰期為90 d，還有一些生長素例如VC 遇空氣中氧、熱、光、堿性物質(zhì)，特別是氧化酶及銅、鐵等金屬離子存在時，可促進其氧化破壞。導(dǎo)致土豆在儲存過程中,有些營養(yǎng)成分含量會降低；商品化速成PDA 粉不僅存在營養(yǎng)成分衰變的問題，還有在加工過程中需要高溫噴霧干燥或高溫烘干工藝，有些營養(yǎng)物質(zhì)會受到一定程度的破壞；此外商品化速成PDA 粉在保質(zhì)期內(nèi)的某些營養(yǎng)成分也可能會隨著時間的延長而流失；所以導(dǎo)致用其培養(yǎng)的微生物生長緩慢、應(yīng)用性能減弱。

由于受季節(jié)限制,微生物科研工作者無法一年四季都能獲得當(dāng)季新鮮土豆。為保證有效的菌株轉(zhuǎn)接培養(yǎng)活化應(yīng)用科研工作的順利進行,建議將當(dāng)季新鮮土豆按每400 g 加1 L 水煮成雙料土豆汁，置于冰箱中冷凍。用時取出所需量融化，加一倍水，再按比例添加葡萄糖和瓊脂即可，使用效果與現(xiàn)配當(dāng)季PDA 相當(dāng)。