師婕，張鈺，許秀峰，胡麗芳，趙巧珍，陳琛，黃丹，李錦，陳煥，陳立早

骨關節(jié)炎(Osteroarthritis,OA)是一類好發(fā)于中老年人的慢性退行性骨關節(jié)病變[1-3]。在多種物理及生化因素的刺激下，金屬蛋白酶、II型膠原和蛋白聚糖等細胞外基質的滲出增多，引起軟骨結構的退變，由此誘發(fā)骨關節(jié)炎的典型表現(xiàn)[4-6]。中晚期骨關節(jié)炎的病理過程不可逆，因此目前研究者專注探索早期骨關節(jié)炎的治療方法[7]。近年來，細胞自噬被認為能抑制骨關節(jié)炎中某些蛋白的形成，如金屬蛋白酶3(Metalloproteinase-3，MMP-3)、活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)、白細胞介素-1(Interleukin-1，IL-1)等，因此在骨關節(jié)炎以及其他年齡相關的疾病中，細胞自噬的激活減弱可能為其重要因素之一[8-12]，這啟發(fā)了研究者們靶向調節(jié)細胞自噬很可能成為一種新型治療骨關節(jié)炎的方法。UNC-51樣激酶1(UNC-51-like Kinase 1,ULK1),Beclin1和微管相關蛋白1輕鏈3(Microtubule-associated Protein 1 Light Chain 3,LC3)是細胞自噬中的關鍵蛋白，其中我們認為ULK1是啟動者，Beclin1是調控者,LC3是執(zhí)行者。

研究發(fā)現(xiàn)，細胞外調節(jié)蛋白激酶(Extracellular regulated protein kinases，ERK)信號轉導通路對細胞自噬具有調控作用[13-16]，但小鼠睪丸支持細胞系中，致癌物質林丹介導的ERK信號通路卻抑制了自噬的發(fā)生。因此，不同疾病中ERK信號通路對細胞自噬的作用不一致。本研究首次探索骨關節(jié)炎中ERK信號通路對細胞自噬的作用，并進一步明確ERK信號通路的作用機制。本研究方案采用ERK信號通路抑制劑U0126行雙膝關節(jié)腔注射的方式，以兔為研究對象，探索ERK途徑在骨關節(jié)炎中對MMP3和細胞自噬的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取24只4個月齡的健康新西蘭雄性大白兔為研究對象，平均體重2kg左右，隨機分為3組，對照組、OA組和OA+U0126組，每組8只。

1.2 對照組 不接受任何干預措施；OA組和OA+U0126組予以連續(xù)3d雙膝關節(jié)腔注射0.1ml 4%的木瓜蛋白酶造模；OA組于造模后15d處死；OA+U0126組：造模7d后；予以0.1ml 100umol/ml的ERK抑制劑U0126連續(xù)3d雙膝關節(jié)腔注射，于造模后15d處死。

1.3 評定標準 ①大體觀察:觀察實驗前后每組兔子毛色的光澤度及體重變化，造模處局部有無紅腫發(fā)熱及壞死，每組兔子自由活動情況和生命體征等。切取雙膝股骨內側髁進行肉眼觀察：關節(jié)軟骨色澤是否暗淡，表面是否光滑，有無增厚、壞死及粘連；滑膜有無增生、粘連；關節(jié)液的色澤、量；關節(jié)腔內有無粘連等變化。②組織學觀察：取每組實驗兔雙側股骨內側髁關節(jié)面軟骨為實驗標本，給予4%多聚甲醛固定并至脫鈣完全。隨后行常規(guī)石蠟包埋和連續(xù)病理切片，分別進行蘇木精-伊紅(Hematoxylin-Eosin Staining，HE)染色、甲苯胺藍及番紅-固綠染色，光鏡下觀察軟骨的形態(tài)變化、細胞簇集及排列是否整齊、基質染色及軟骨表面裂隙及纖維化等情況。通過甲苯胺藍染色半定量分析糖胺聚糖(Glycosaminoglycan,GAG)。采用雙盲法按國際骨關節(jié)炎研究學會(Osteoarthritis Research Society International，OARSI) 軟骨病理變化評分標準[17]。OARSI評分根據HE和番紅-固綠染色，計算分期(0～4期)*分級(0～5級)的總分來評價OA嚴重程度。且OARSI評分小于12分被定義為骨關節(jié)炎早期；OARSI分級為1級時，關節(jié)軟骨即有早期退變。OARSI評分的分數(shù)越高，則說明骨關節(jié)炎病變越嚴重。③蛋白免疫印跡：按蛋白免疫印跡法測定樣品中的蛋白濃度，經電泳、轉膜、封閉、一抗、二抗敷育以及ECL顯色曝光后，通過圖像分析軟件IPP6進行灰度分析檢測空白對照組、OA組和OA+U0126組中MMP3、磷酸化的ERK(P-ERK)、ULK1、自噬相關蛋白Beclin1和LC3II/LC3I的灰度值。

2 結果

2.1 大體觀察 3組兔子實驗前后的體重以及體重的變化各組兩兩比較差異無統(tǒng)計學意義，見表1。對照組軟骨表面光滑較薄，色澤明亮，未見裂隙，觸之較硬；關節(jié)滑膜未見增生和水腫等；關節(jié)液無滲出。OA+U0126組與對照組比較，軟骨色澤稍暗，膝關節(jié)軟骨表面稍增厚，關節(jié)內滑液明顯增多。OA組軟骨增厚變粗糙最明顯，滑液最多。

表1 3組兔子的體重比較

2.2 關節(jié)軟骨光鏡下觀察 OA組明顯可見軟骨表面增厚出現(xiàn)裂隙，軟骨細胞增生，細胞基質失染以及細胞排列紊亂和簇集等典型骨關節(jié)炎改變。OA+U0126組軟骨增厚、細胞增生排列紊亂等改變比OA組輕。見圖1，2，3。實驗后，OA+U0126組和OA組GAG含量均低于對照組(均P<0.05)；OA+U0126與OA組比較，GAG含量升高(P<0.01)。OA+U0126組和OA組OARSI評分均明顯高于對照組(均P<0.05)；OA+U0126組與OA組比較，OARSI評分降低(P<0.01)。見表2。

2.3 蛋白免疫印跡 實驗后,OA+U0126組和OA組 P-ERK、MMP3含量較對照組均升高(均P<0.05)，LC3II/LC3I、ULK1和Beclin1含量較對照組均降低(均P<0.05)。OA+U0126組與OA組比較，P-ERK、MMP3含量均降低(均P<0.05)，LC3II/LC3I、ULK1和Beclin1含量均升高(均P<0.05)。見圖4和表3。

表2 3組兔實驗后GAG含量與OARSI評分比較

與對照組比較，aP<0.05；與OA組比較，bP<0.01

表3 3組蛋白免疫印跡結果比較

與對照組比較，aP<0.05；與OA組比較，bP<0.05

圖1 甲苯胺藍染色 (倍數(shù):10×10)

圖2 HE染色(倍數(shù):10×10)

圖3 番紅-固綠染色(倍數(shù):10×10)

圖4 3組蛋白免疫印跡檢測結果比較

3 討論

OARSI評分系統(tǒng)在2016年進一步修改，將分級細化，增加了0.5分、1.5分、2.5分、3.5分及4.5分等區(qū)間[18]。根據新版OARSI評分以及我們之前的研究結果, 木瓜蛋白酶造模后15d，軟骨OARSI評分接近12分，可作為早期骨關節(jié)炎的臨界點。因此，本實驗設計在木瓜蛋白酶造模15d時將新西蘭大白兔處死，取股骨內側髁軟骨標本進行研究。研究結果中，每組OARSI評分均小于12分，證實本實驗成功建立了早期骨關節(jié)炎模型，而OA+U0126組中OARSI評分較OA組減少，差異具有統(tǒng)計學意義，提示膝關節(jié)腔注射ERK抑制劑U0126可部分逆轉骨關節(jié)炎病理改變。

MMP3作為OA的標記蛋白之一，與軟骨細胞的退變密切相關。ERK信號通路激活后發(fā)生磷酸化，可參與細胞的增殖分化生長等，當ERK過度激活時，可抑制細胞增殖及凋亡。本研究中，蛋白免疫印跡結果可見，ERK抑制劑U0126經膝關節(jié)腔注射后，OA+U0126組中MMP3含量比OA組低；組織學觀察發(fā)現(xiàn)，OA+U0126組中軟骨表面侵犯、軟骨細胞退變等病理改變比OA組輕，該結果支持前人對ERK信號通路在骨關節(jié)炎中作用的結論，證實了ERK信號通路在早期骨關節(jié)炎中對MMP3有調節(jié)作用，ERK抑制劑U0126可減少MMP3的形成，減少關節(jié)軟骨退變，抑制軟骨細胞凋亡，從而減緩OA的發(fā)展。反向證明了ERK信號通路可加重骨關節(jié)炎改變，而且其作用機制與促進MMP3的生成密切相關。

本研究通過ERK抑制劑U0126行兔膝關節(jié)腔注射來觀察細胞自噬的作用，發(fā)現(xiàn)U0126抑制后，自噬相關蛋白Beclin1、ULK1和LC3II/LC3I均明顯升高。Beclin1, ULK1和LC3II/LC3I分別于自噬的成核階段和延長階段起關鍵作用。成核階段，在內質網和高爾基體中，哺乳類動物關鍵蛋白mTOR通過與ULK1復合物(ULK1、Atg13、Atg101和FIP200組成)相互作用，將細胞外刺激信號整合成自噬特異性信號，然后Beclin1激活與VPS34和VPS15相組合成復合體，通過與多種自噬相關蛋白結合，從而誘導自噬體的形成。延長階段，LC3前體LC3I被自噬蛋白Atg4B迅速切割，被Atg7激活后，與Atg3和Atg5-Atg12-Atg16復合物連接起來，形成了具有能與自噬體膜相結合能力的LC3II，從而識別細胞器。隨后自噬體繼續(xù)發(fā)育成熟，與溶酶體相融，形成自噬溶酶體并最終降解。 本實驗結果證明了ERK抑制劑U0126對細胞自噬的激活作用貫穿于整個自噬過程，ULK1的改變提示U0126很可能在細胞自噬的成核階段即產生了作用，加強了信號傳導，激活了更多Beclin1，吞噬了凋亡的軟骨細胞器和細胞碎片并最終將其清除。由此，反向證明了ERK信號通路在早期骨關節(jié)炎中可抑制細胞自噬作用，從而加重骨關節(jié)炎。

本研究通過抑制ERK信號通路，檢測細胞自噬3個不同階段的關鍵蛋白發(fā)現(xiàn)，細胞自噬很可能在成核階段即受到ERK信號通路的調控作用,可減輕早期OA的病理改變。而本研究為動物實驗，可完善體外試驗進一步證實研究結論。今后研究將詳細探究ERK信號通路對細胞自噬的具體作用機制，以及影響骨關節(jié)炎發(fā)生發(fā)展、影響細胞自噬的其他因素，從而為探索骨關節(jié)炎的治療方案提供新思路。