洪 揚，王金霞，李方林，陳懿建

(1.贛南醫(yī)學(xué)院 a.2017級碩士研究生；b.第一附屬醫(yī)院血液科，江西 贛州 341000；2.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江西 南昌 330000)

再生障礙性貧血(Aplastic Anemia, AA)是一種以骨髓發(fā)育不全和外周血全血細(xì)胞減少為特征的骨髓衰竭綜合征[1]?；颊咄蕾囉谘旱妮斪?，未及時治療易導(dǎo)致死亡，最常見的是感染或出血[2]。目前治療主要集中在造血干細(xì)胞(hemopoietic stem cells, HSCs)移植或抑制免疫介導(dǎo)的骨髓干細(xì)胞破壞。已有研究表明再生障礙性貧血患者間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)的體外造血支持作用和免疫抑制能力顯著降低。骨髓基質(zhì)的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(Mesenchymal stromal cells, MSCs)為HSCs提供了一個利基，在調(diào)節(jié)和維持造血中起著重要的作用。目前已有較成熟的體外分離、培養(yǎng)、增殖MSCs的方法，研究發(fā)現(xiàn)MSCs輸注可以恢復(fù)骨髓造血微環(huán)境、產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，MSCs還在調(diào)節(jié)移植免疫方面發(fā)揮著重要作用，可以降低移植物抗宿主病(Graft versus host disease, GVHD)的發(fā)生。本文就MSCs免疫特性及其在再障中的研究作一綜述。導(dǎo)致AA骨髓造血衰竭的確切機(jī)制尚不清楚，可能包括:原發(fā)性HSCs缺陷、免疫介導(dǎo)的造血抑制、BM微環(huán)境缺陷或兩者的結(jié)合[3]。目前再生障礙性貧血的治療方法為雄激素、免疫抑制治療或造血干細(xì)胞移植。最新研究表明孢素A(Cyclosporin A, CsA)聯(lián)合抗胸腺細(xì)胞IST(immunosuppressive therapy, IST)可明顯改善重型再生障球蛋白(Antithymocyte globulin, ATG)的免疫抑制治療礙性貧血(Severe aplastic anemia, SAA)患者的生存率，但只對40%～60%患者有效[4]，免疫抑制治療的目的在于通過抑制異?；罨腡細(xì)胞，避免造血組織的進(jìn)一步損傷，促進(jìn)受損的造血干/祖細(xì)胞恢復(fù)造血[5]。但是造血干細(xì)胞移植仍然是治療再障的一線選擇，但由于我國獨生子女比較多，人類白細(xì)胞抗原(Human leukocyte antigen, HLA)相合配型比較困難，且費用昂貴，5%～15%的患者因GVHD影響生活質(zhì)量。因此有必要探索一種新的治療手段[6]。研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞是一種多能干細(xì)胞,能夠與造血干細(xì)胞相互作用,提供造血干細(xì)胞生長所需的基質(zhì)及生長因子、改善造血微環(huán)境，恢復(fù)骨髓造血功能。

1 再生障礙性貧血

1.1再障患者M(jìn)SCs的異常最新研究結(jié)果表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞功能缺陷可能與再生障礙性貧血的發(fā)病機(jī)制有關(guān)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為造血微環(huán)境的重要組成部分，功能缺陷可能導(dǎo)致造血微環(huán)境紊亂，為了驗證這一假說，我們將再生障礙性貧血患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的基本特征與對照組進(jìn)行了比較，以確定再生障礙性貧血病理生理過程中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的變化。研究發(fā)現(xiàn)[7]AA患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞明顯異常,表現(xiàn)為分化缺陷、血管生成減少、骨髓脂肪化?；虮磉_(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，AA患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中有300多個基因差異性表達(dá)[8]：這包括細(xì)胞凋亡和免疫應(yīng)答相關(guān)基因的上調(diào)[8]，此外AA患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞通過趨化因子(CXCL12)和成纖維細(xì)胞生長因子(Fibroblast growth factor, FGF1)表達(dá)下調(diào)[9-10]而降低其增殖潛能。再生障礙性貧血患者及對照組骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂后的表達(dá)，與對照組相比，再生障礙性貧血患者脂肪細(xì)胞內(nèi)脂肪滴較少，體積較小。

1.2 MSCs在再障小鼠模型中的研究李佩恩等[11]將人骨髓 MSCs(1×106/只)輸注給 AA小鼠,21 d后治療組血象逐漸恢復(fù)，而模型組血象未恢復(fù)，小鼠股骨病理切片顯示治療組脂肪細(xì)胞比例明顯低于AA模型組，與單純照射組結(jié)果一致。董毅等[12]將MSCs(1×106/只)輸注給AA小鼠后28 d后模型組小鼠存活率為20%，而MSCs治療組存活率73.3%，外周血象14 d后MSCs輸注組已開始恢復(fù),28 d恢復(fù)正常,而模型組血象仍未恢復(fù)。通過動物實驗表明間充質(zhì)干細(xì)胞輸注，治療再障小鼠有效，與正常小鼠相比較SAA小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells, BMMSCs)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生了改變：MSCs體積明顯增大,呈平鋪、邊界不清，和正常小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞明顯不同[13]。王萍等[14]在動物實驗中發(fā)現(xiàn)HSCs聯(lián)合MSCs輸注可顯著提升外周血及骨髓中有核細(xì)胞數(shù)量,并且證明輸注的MSCs可長期存在于造血微環(huán)境中。有研究發(fā)現(xiàn)，接受致死劑量放療，導(dǎo)致骨髓抑制的小鼠，MSCs后骨髓可恢復(fù)造血功能,MSCs的作用在輸注的早期即可起效[15]。

2 間充質(zhì)干細(xì)胞治療再障的機(jī)制

2.1 MSCs的免疫調(diào)節(jié)作用1996年Friedenstein發(fā)現(xiàn)了間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)[16]，MSCs在造血干細(xì)胞的存活和分化過程中，作為BM微環(huán)境的重要組成部分。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)來源廣泛,易于分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增，有著多向分化潛能、低免疫原性，易于接受外源基因的導(dǎo)入，廣泛的用于組織工程細(xì)胞和基因載體細(xì)胞[17]，間充質(zhì)干細(xì)胞能夠增強(qiáng)造血干細(xì)胞移植后的植入，能夠自我復(fù)制，與造血干細(xì)胞相互作用，提供造血干細(xì)胞生長所需的基質(zhì)及生長因子，還能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能。研究表明，臍血和胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對不同的T細(xì)胞亞群具有調(diào)節(jié)免疫活性[18]，CD4 T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫被認(rèn)為是獲得性急性干細(xì)胞破壞的主要機(jī)制。MSCs調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的機(jī)制包括與各種免疫細(xì)胞相互作用，在不同的微環(huán)境中分泌可溶性介質(zhì)[19-20]。此外間充質(zhì)干細(xì)胞具有低免疫原性，抑制免疫排斥反應(yīng)，促進(jìn)免疫重建。MSCs不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子(Major histocompatibility complex, MHCII)、B7-1、B7-2、CD40、CD40L及Fas配體。因此很難被機(jī)體的免疫系統(tǒng)識別，這為間充質(zhì)干細(xì)胞的臨床應(yīng)用打下基礎(chǔ)。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對T細(xì)胞、NK細(xì)胞和抗原提呈細(xì)胞，具有顯著的免疫抑制作用。

2.2 MSCs改善人造血微環(huán)境骨髓造血微環(huán)境由骨基質(zhì)細(xì)胞、胞外基質(zhì)及一些細(xì)胞因子等組成。骨髓基質(zhì)細(xì)胞包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)以及一些較成熟細(xì)胞，如成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞等,通過分泌某些細(xì)胞因子調(diào)控HSCs的生理功能。以往的研究表明，獲得性AA表現(xiàn)為造血干/祖細(xì)胞(Hematopoietic stem cells/hematopoietic progenitor cells, hSCs/hpcs)和造血微環(huán)境的異常，而造血微環(huán)境通常是由免疫異常介導(dǎo)的[21]?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，AA患者的造血干/祖細(xì)胞在多種生物學(xué)特性和功能上存在缺陷，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為骨髓微環(huán)境的關(guān)鍵前體細(xì)胞，在血細(xì)胞形成過程中起著重要的作，MSCs分化為多種基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成HSCs生態(tài)位，分化后的MSCs支持造血，幾乎調(diào)節(jié)全身免疫細(xì)胞功能，維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)。BM-MSCs在維持長期造血中起著重要作用，有研究表明，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺陷可抑制造血功能。Fouillard L等報道[22]1例6歲的難治性AA患者，無法進(jìn)行造血干細(xì)胞移植(Hematopoietic stem cell transplantation, HCT)治療，并先后兩次接受其子的MSCs輸注,不幸的是，患者死于大量感染，但尸檢顯示骨髓基質(zhì)有所改善，但造血沒有明顯改善[23]。在另一項研究中，18例患者接受了第三方骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的注射，33%的患者至少對治療有部分反應(yīng)，避免了輸血的需要[24]。另一研究采用了每周注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，但發(fā)現(xiàn)骨髓移植不良。然而在這9例患者中3例確實有部分反應(yīng)，并能夠獨立輸血。最近研究發(fā)現(xiàn)[24]53例患者在體外擴(kuò)增后接受了來自匹配、半相合或無關(guān)供體的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，MSCs輸注在1年時，總有效率為28.4%。這些初步研究支持MSCs改善骨髓基質(zhì)，減輕部分AA患者的癥狀。

2.3 MSCs分泌多種細(xì)胞因子支持造血作用MSCs通過分泌各種細(xì)胞因子和可溶性分子對免疫系統(tǒng)具有抑制或調(diào)節(jié)作用，這些可溶性分子可以遷移到特定的受損部位發(fā)揮長時間免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)。這對于AA改善骨髓微環(huán)境、保護(hù)造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞尤為重要。據(jù)推測，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞缺陷可能會阻止足夠的造血功能。此外MSCs還可以產(chǎn)生多種具有調(diào)控和支持造血的物質(zhì)：如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, GM-CSF)、白介素(Interleukin, IL-Ii)等多種黏附分子。在AA患者中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞具有抑制增殖和分化潛能，并且缺乏抑制T淋巴細(xì)胞活化、增殖和釋放細(xì)胞因子的能力。在體外研究中[25]MSCs可以通過G0/G1期阻斷活化的T細(xì)胞(CD4和CD8細(xì)胞)的增殖。間充質(zhì)干細(xì)胞存在于骨髓非造血組織中,具有高度增殖、自我更新及多項分化潛能，對T淋巴細(xì)胞具有較強(qiáng)的免疫抑制作用。AA患者體內(nèi)的干細(xì)胞增殖潛能較弱,對造血島形成的支持作較差。Xiao等[26]報道了18例接受MSCs治療的難治性AA患者，隨訪1年6例患者(33.3%)完全緩解(complete remission, CR)或部分緩解(Partial remission, PR)，而對照組中僅1例患者達(dá)到部分緩解。CHEN等[27]研究發(fā)現(xiàn)MSCs促進(jìn)HSCs植活并可能加速造血恢復(fù)，MSCs分泌SDF-1使HSCs通過SDF-1/CXCR4軸進(jìn)入骨髓，HOXB4可促進(jìn)HSCs自我更新MSCs分泌的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)和HOXB4均能促進(jìn)射線照射后小鼠的造血恢復(fù)，WBC、PLT、HGB在外周血及骨髓中均快速恢復(fù)，這表明MSCs聯(lián)合HSCs治療再生障礙性貧血是安全可行的，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

3 MSCs聯(lián)合HSCs治療AA

MSCs是骨髓造血微環(huán)境的重要成分,具有促進(jìn)造血干細(xì)胞的分化和增殖、抗炎、修復(fù)損傷組織、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫等作用。最新動物實驗及部分臨床實驗證實，MSCs聯(lián)合HSCT輸注有助于可提高AA患者的造血重建率及免疫功能，減輕GVHD和移植后排斥反應(yīng)[28]。MSCs輸注在HSCs輸注前后也被預(yù)先使用；這種方法縮短了植入時間，中性粒細(xì)胞和血小板在造血干細(xì)胞移植(HSCT)后12天植入，短于歷史對照組[29]。另外包括半相合供體HSCT在內(nèi)的替代供體移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞加入方案后[30]，植入時間較短。LIU等最近的一項Ⅱ期研究[31]證實了這些發(fā)現(xiàn)，當(dāng)骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞給予半相合HSCT時，97.6%的患者造血功能有所恢復(fù)，但是這些都是小樣本研究，還需進(jìn)一步研究。另外WANG等[32]研究證實了半相合HSCT聯(lián)合MSCs輸注治療復(fù)發(fā)難治性血液病的有效性。

4 MSCs 治療 GVHD

GVHD仍然是限制廣泛使用異基因造血干細(xì)胞移植(Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)的原因之一，是危及生命的并發(fā)癥[33]。HSCT與供體來源的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用是安全可行的，MSCs輸注有利于恢復(fù)造血功能、減少感染的發(fā)生、降低死亡率，降低GVHD的嚴(yán)重程度。比利時的一項研究表明[34]，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞輸注顯著降低了急性移植物抗宿主病(Acute graft versus host diseasea, GVHD)的發(fā)生率。MSCs不僅能抑制T細(xì)胞的增殖和活化，而且還能調(diào)節(jié)輔助T細(xì)胞(Regulating helper T cells)的分化，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Tregs)作為輔助性細(xì)胞的重要亞群，在誘導(dǎo)外周免疫耐受中起著至關(guān)重要的作用，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能促進(jìn)Tregs的產(chǎn)生降低GVHD的發(fā)生。間充質(zhì)干細(xì)胞聯(lián)合骨髓和外周血干細(xì)胞移植能夠改善骨髓微環(huán)境，促進(jìn)造血植入，進(jìn)一步降低移植物抗宿主病發(fā)生率。

5 結(jié) 語

綜上所述，越來越多的研究表明，間充質(zhì)干細(xì)胞可促進(jìn)移植造血干細(xì)胞的歸巢，改善造血微環(huán)境，產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，加速造血功能的恢復(fù)，降低GVHD的發(fā)生。間充質(zhì)干細(xì)胞在AA治療中有著顯著的療效。但是不同的研究對MSCs的治療效果評價不盡相同，多數(shù)研究表明MSCs具有良好的細(xì)胞治療前景，但仍有諸多困難有待攻克：首先還沒有建立規(guī)范的MSCs生產(chǎn)流程，MSCs輸注的種類、劑量、頻次、間隔時間等尚沒有統(tǒng)一意見；其次針對間充質(zhì)干細(xì)胞的安全性和有效性、有無并發(fā)癥等問題，目前尚缺乏足夠、可靠的臨床依據(jù)，以及如何建立有效的擴(kuò)增體系以滿足MSCs的臨床需要。隨著對間充質(zhì)干細(xì)胞深入研究，將為臨床應(yīng)用打下堅實的基礎(chǔ)?？傊?，充分探索間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫學(xué)特性和所存在的問題，將有望為臨床治療AA開闊新的前景、創(chuàng)造新的希望。