陳永華，林碧蕓，李小芳，李南紅，袁振興

臨床上含有黑色素的腫瘤較多，良性的有痣，惡性的有黑色素瘤、原始神經(jīng)外胚層腫瘤、透明細(xì)胞肉瘤等，免疫組化是鑒別上述腫瘤的重要輔助手段，然而黑色素的存在，嚴(yán)重影響免疫組化結(jié)果的判讀。因此，尋找一種對(duì)組織結(jié)構(gòu)及免疫組化指標(biāo)表達(dá)影響盡可能小的脫黑色素方法對(duì)病理診斷意義重大。目前，常用的脫色素法有高錳酸鉀/草酸法和過氧化氫法，均可以把色素脫除干凈，但是會(huì)破壞組織。本科室采用兩種pH的溶劑配制濃度為1.8%的H2O2溶液在70 ℃時(shí)對(duì)組織進(jìn)行脫色素處理，并行免疫組化染色，取得良好效果，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料選取我院2015年1月～2017年12月病理確診為黑色素瘤，且富含黑色素顆粒的12例存檔蠟塊。另選取3例HE染色顯示極少黑色素的黑色素瘤作為對(duì)照組。

1.2 試劑雙氧水消毒液購自南國藥業(yè)公司，分析純氫氧化鈉購自天津凱通化學(xué)公司，PBS、一抗Ki-67、HMB-45及免疫組化MaxVison試劑盒，均購自福州邁新公司。

1.3 方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)分組 所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定8～36 h，常規(guī)脫水、透明和石蠟包埋，4 μm厚切片，每例蠟塊切9張白片，用氨丙基三乙氧基硅烷(APES)黏附載玻片撈片，經(jīng)65 ℃烤片2 h。實(shí)驗(yàn)分為未處理組、PBS組、NaOH組。

1.3.2脫黑色素 富含黑色素組織與極少色素組織分別切片于二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各10 min，梯度乙醇水化，自來水沖洗并浸泡于蒸餾水中待用，若手工方法做免疫組化染色，切片經(jīng)抗原修復(fù)后冷卻至室溫，水洗待用，經(jīng)預(yù)先在水浴箱孵育至70 ℃分別由PBS(pH 7.4～7.6)、NaOH(pH 10.0)配制濃度為1.8%的H2O2溶液，每隔10 min取出鏡下觀察，直至黑色素完全褪去，記錄時(shí)間。若150 min內(nèi)未褪去全部黑色素，亦停止脫黑色素。不做脫色素處理的切片脫蠟至水即可，然后復(fù)染蘇木精，脫水、透明、封固。

1.3.3免疫組化 富含黑色素組織與極少色素組織分別選取Ki-67、HMB-45抗體行免疫組化染色。(1)未處理組：組織切片抗原修復(fù)至常溫后，切片滴加過氧化物酶阻斷劑孵育10 min，PBS沖洗3 min×3次；除去PBS后，滴加一抗室溫下孵育60 min，PBS沖洗3 min×3次，采用免疫組化MaxVison法進(jìn)行檢測(cè)。(2)脫黑色素組：切片經(jīng)抗原修復(fù)后，PBS(pH 7.4～7.6)、NaOH(pH 10.0)配制濃度為1.8%的H2O2溶液處理，流水沖洗10 min，采用免疫組化MaxVison法進(jìn)行檢測(cè)(圖1)。

圖1 實(shí)驗(yàn)步驟示意圖

2 結(jié)果

未處理組的切片，經(jīng)脫蠟復(fù)染蘇木精后組織可見大量棕黃色的黑色素顆粒覆蓋在腫瘤細(xì)胞上，進(jìn)行免疫組化染色時(shí)黑色素顆粒與DAB顯色的顏色互相混淆，無法分辨(圖2)。

本實(shí)驗(yàn)是溫度為70 ℃時(shí)玻片經(jīng)脫黑色素處理后，所有組織在PBS(pH 7.4～7.6)配制的1.8%H2O2溶液中100～130 min黑色素可完全脫去，且組織結(jié)構(gòu)完整，無脫片現(xiàn)象；在NaOH(pH 10.0)配制的溶液經(jīng)70～90 min黑色素可完全脫去，組織結(jié)構(gòu)基本完整，組織稍有卷曲。兩種脫色素處理后的切片均行免疫組化HMB-45染色，可見腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)呈棕黃色，免疫組化Ki-67染色可見部分細(xì)胞核呈棕黃色(圖2)。

極少黑色素組中未做處理與兩種pH溶劑配置的1.8% H2O2溶液處理的蘇木精復(fù)染與免疫組化染色結(jié)果基本一致。

3 討論

黑色素是一種黃褐色或棕褐色的細(xì)顆粒，大小不等，形狀不一，性質(zhì)穩(wěn)定，來源于神經(jīng)脊，在胚胎發(fā)育過程中，由神經(jīng)脊移行到皮膚等處。正常情況下黑色素存在于毛發(fā)、皮膚基底層等，在病理情況下，黑色素多見于惡性黑色素瘤及一些良性病變，如色素痣等。免疫組化染色應(yīng)用DAB顯色系統(tǒng)時(shí)，黑色素顆粒的存在會(huì)影響組織病理學(xué)評(píng)估。因此，需進(jìn)行脫黑色素處理。

顏亞暉等[1]在標(biāo)本脫水前就進(jìn)行脫黑色素處理獲得較好的效果，但該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，且脫黑色素時(shí)間與黑色素的含量呈正比，脫色時(shí)間難以掌握。吳瓊等[2]在常規(guī)免疫組化染色DAB步驟后，應(yīng)用甲苯胺藍(lán)溶液或Giemsa溶液把黑色素復(fù)染為可以區(qū)分DAB色素中的黑色素顆粒。該方法將腫瘤細(xì)胞表達(dá)抗原用DAB染成棕色并將黑色素顆粒染成墨綠色或者綠色，當(dāng)黑色素較少且無覆蓋組織時(shí)效果較好；若黑色素較多時(shí)，染色后的黑色素顆粒，物理遮蓋的問題仍然存在，遮蓋物會(huì)影響免疫組化結(jié)果的判斷。因此，不適用于含大量黑色素的組織。高錳酸鉀-草酸脫黑色素是使用最廣泛的漂白方法，雖然其快速有效，但于曉東等[3]認(rèn)為傳統(tǒng)的高錳酸鉀法容易掉片，在加熱煮沸的情況下易加劇脫片的幾率[4]，且漂白使組織損傷和細(xì)胞分子丟失，后續(xù)免疫組化染色的強(qiáng)度與定位受影響較大[5]。

圖2 富含黑色素的未處理組與PBS、NaOH組處理脫色素景深掃描及免疫組化HMB-45、Ki-67染色，MaxVision法

H2O2法也常用于脫黑色素，室溫下對(duì)組織的抗原性基本無影響，但耗時(shí)較長(zhǎng)，無法滿足臨床診斷的需求[3,6]。陳瓊榮等[7]采用3% H2O2在55 ℃處理2 h嚴(yán)重脫片。本實(shí)驗(yàn)選取1.8% H2O2溶液，把溫度提高至70 ℃，經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證組織完全脫去色素后，結(jié)構(gòu)完整，無脫片現(xiàn)象，且對(duì)后續(xù)免疫組化指標(biāo)Ki-67及HMB-45染色無影響。

本科室經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，采用PBS(pH 7.4～7.6)、NaOH(pH 10.0)配制的1.8% H2O2溶液在70 ℃時(shí)經(jīng)70～130 min將色素脫干凈，組織結(jié)構(gòu)完整。極少黑色素組未做處理與兩種pH溶劑配置1.8% H2O2溶液處理的蘇木精復(fù)染與免疫組化結(jié)果基本一致，證明兩種脫黑色素法在完全脫去黑色素的時(shí)間內(nèi)對(duì)免疫組化染色的影響較小。該方法能夠滿足臨床、病理醫(yī)師對(duì)含有黑色素腫瘤的診斷及鑒別診斷，耗時(shí)較短，值得推廣應(yīng)用。