任永強，李慶華，黃新建，董 麗

皮膚鱗狀細胞癌(簡稱皮膚鱗癌)來源于皮膚的鱗狀上皮組織，是我國常見的皮膚惡性腫瘤之一，好發(fā)于老年人，至今病因尚未明確，認為可能與化學致癌劑、慢性炎癥、人乳頭瘤病毒感染等有關[1]。因此，了解皮膚鱗癌的發(fā)病機制，尋找其發(fā)生過程的關鍵分子，對于其診療具有重要意義。垂體腫瘤轉化基因(pituitary tumor transforming genes, PTTG)是新近發(fā)現(xiàn)的一個原癌基因，參與細胞增殖、凋亡、分化及信號轉導等，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關[2]。有研究表明，PTTG在多種腫瘤組織和細胞中高表達，如食管鱗狀細胞癌、結直腸癌等，其高表達可促進腫瘤細胞增殖[3]。有關皮膚鱗癌中PTTG的研究較少，文獻報道下調PTTG基因表達可明顯抑制皮膚鱗癌細胞的增殖和遷移，下調MMP-2和MMP-9的表達，并在裸鼠移植瘤模型中得到證實[4-5]。PI3K/AKT信號通路是細胞內(nèi)一條重要的信號途徑，參與細胞增殖、凋亡、侵襲轉移等過程，其激活可促進腫瘤細胞生長[6]。PTTG是否可抑制PI3K/AKT信號通路影響皮膚鱗癌細胞凋亡還未明確。因此，本實驗通過RNA干擾(RNAi)抑制人皮膚鱗癌細胞系A431中PTTG的表達，旨在探討抑制PTTG表達對A431細胞活力、凋亡的影響，并進一步探討對PI3K/AKT信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素和鏈霉素均購自美國Gibco公司；MTT、DMSO、ROS檢測試劑盒均購自美國Sigma公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒、流式細胞儀均購自美國BD公司；LY294002及PTTG、AKT、p-AKT、Cyclin D1和Bax抗體均購自美國CST公司；酶標儀購自美國Thermo公司。

1.2 細胞培養(yǎng)人皮膚鱗癌細胞系A431購自中國科學院上海細胞庫。細胞使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，在5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)傳代培養(yǎng)。實驗為生長至對數(shù)期的細胞。

1.3 轉染轉染前1天，以每孔3×105個接種生長至對數(shù)期的A431細胞于6孔板，每孔2 mL，次日，待細胞達70%～80%生長融合度時進行轉染。轉染參照Lipofectamin 2000試劑盒說明。轉染4 h后，更換為含血清的完全培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中常規(guī)孵育48 h。收獲細胞，進行后續(xù)實驗研究。實驗分組：空白組(未轉染的空白細胞)(n=3)、NC組(轉染無干擾作用siRNA)(n=3)和si-PTTG組(轉染si-PTTG)(n=3)，每組設3個重復。

1.4 MTT法檢測細胞活力以每孔1.0×104個接種A431細胞于96孔板，每孔100 μL，于5%CO2、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，將si-PTTG轉染至細胞，轉染24、48和72 h，每孔中加入20 μL MTT(5 mg/mL)，培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，終止培養(yǎng)，每孔中加DMSO 200 μL，震蕩10 min。酶標儀上，選擇490 nm波長，調零后測定各孔的吸光度值(A)。以A值反映細胞活力。每組設置5個重復孔，實驗重復3次。

1.5 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率以每孔3×105個將si-PTTG平鋪在6孔板內(nèi)，轉染48 h后，吸出細胞培養(yǎng)液，轉移至離心管，用含1%FBS的PBS洗滌細胞，不含EDTA的胰酶消化細胞，離心，棄去培養(yǎng)液，收集(1～5)×105個細胞，參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明，通過流式細胞儀檢測(1 h內(nèi))。實驗重復3次。

1.6 Western blotsiRNA轉染A431細胞48 h，提取細胞總蛋白。BCA法定量蛋白。按照每孔50 μg上樣，經(jīng)SDS-PAGE分離、轉膜、封閉、洗膜，加PTTG、AKT、p-AKT、Cyclin D1和Bax一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，洗膜，加HRP標記的二抗稀釋液，室溫孵育1～2 h，加ECL發(fā)光液，在暗盒中使用X光膠片曝光，拍照。Quantity One軟件進行灰度值分析。以目的蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值為各蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.7 流式細胞術檢測ROS含量siRNA轉染A431細胞48 h，收集細胞，參照ROS檢測試劑盒說明，將適量DCFH-DA加入所有孔中(上機前30 min)，培養(yǎng)箱中孵育30 min，胰酶消化細胞，離心，PBS洗滌細胞及重懸細胞后，通過流式細胞儀測定。實驗重復3次。

2 結果

2.1 siRNA轉染A431細胞后PTTG蛋白表達PTTG的特異性siRNA轉染A431細胞48 h，采用Western blot法檢測轉染效果(圖1)，si-PTTG組PTTG表達明顯低于空白組(P<0.05)，而NC組與空白組PTTG表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 Western blot法檢測siRNA轉染A431細胞后PTTG蛋白表達

2.2 沉默PTTG表達對A431細胞活力的影響MTT法檢測轉染si-PTTG的A431細胞活力，si-PTTG轉染A431細胞24、48和72 h，細胞活力均明顯降低，與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖2)。

圖2 沉默PTTG表達后的A431細胞生長曲線

2.3 沉默PTTG表達對A431細胞凋亡及ROS產(chǎn)生的影響si-PTTG轉染A431細胞48 h，通過流式細胞術及ROS試劑盒分別檢測細胞凋亡率及ROS水平，與空白組比較，si-PTTG組細胞凋亡率及ROS含量均明顯升高(P<0.05，圖3)。

2.4 沉默PTTG表達對A431細胞PI3K/AKT信號通路的影響Western blot法檢測轉染si-PTTG 48 h的A431細胞AKT、p-AKT、Cyclin D1和Bax蛋白的表達，結果顯示，與空白組比較，si-PTTG組p-AKT和Cyclin D1表達明顯降低，Bax表達明顯升高(P<0.05，圖4)。三組間AKT表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.5 抑制PI3K/AKT信號通路對A431細胞活力的影響與空白組比較，LY294002組細胞活力明顯降低(P<0.05，圖5)，而si-PTTG+LY294002組細胞活力明顯低于LY294002組(P<0.05)。

2.6 抑制PI3K/AKT信號通路對A431細胞凋亡的影響LY294002組細胞凋亡率明顯高于空白組，而si-PTTG+LY294002組細胞凋亡率高于LY294002組(P<0.05，圖6)。

圖3 流式細胞術檢測沉默PTTG表達后的A431細胞凋亡率及ROS含量

圖4 Western blot法檢測沉默PTTG表達對A431細胞PI3K/AKT信號通路影響

圖5 抑制PI3K/AKT信號通路后A431細胞生長曲線

3 討論

人PTTG基因定位于染色體5q33，是新近發(fā)現(xiàn)的一種原癌基因，對血管生成、細胞周期調控、基因調控、染色體穩(wěn)定性維持、細胞凋亡等多個方面均有調控作用[7]。正常組織中PTTG不表達或弱表達，而在腫瘤組織及細胞中呈明顯高表達，其表達與腫瘤生長密切相關[8]。有研究顯示，通過RNAi干擾PTTG基因表達可明顯抑制腦膠質瘤細胞的增殖，阻滯細胞周期[9]。上述研究提示PTTG在腫瘤中的重要作用。已有研究表明，通過RNAi抑制PTTG表達可降低皮膚鱗癌細胞的增殖和轉移[4]。本實驗旨在探討PTTG表達抑制對皮膚鱗癌細胞凋亡的影響及機制，結果顯示，RNAi沉默PTTG表達可明顯抑制皮膚鱗癌A431細胞活力，誘導細胞凋亡。提示抑制PTTG表達可能是皮膚鱗癌基因治療的手段之一。

ROS是一類含氧的具有化學活性的分子，ROS適度升高對細胞增殖和分化具有促進作用，而過高的ROS水平可引起脂質、蛋白及DNA的氧化損傷。腫瘤細胞內(nèi)ROS水平被誘導后繼續(xù)升高，可引起細胞凋亡[10]。因此，誘導腫瘤細胞ROS產(chǎn)生已成為腫瘤治療的手段之一。有研究表明，誘導皮膚鱗癌細胞ROS產(chǎn)生可明顯促進癌細胞凋亡[11]。本實驗結果顯示，沉默PTTG表達可明顯誘導A431細胞ROS產(chǎn)生。提示誘導ROS產(chǎn)生可能是沉默PTTG表達誘導皮膚鱗癌細胞凋亡的機制之一。

PI3K/AKT信號通路是細胞內(nèi)與腫瘤密切相關的重要的信號途徑，可通過促進腫瘤細胞增殖、存活、侵襲遷移、新生血管形成及抑制細胞凋亡等一系列方式促進腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，因而成為腫瘤研究中的熱點[12]。有研究表明，慢病毒介導的PTTG基因表達沉默可通過調節(jié)PI3K信號通路抑制垂體腺瘤細胞的增殖和侵襲能力[13]。Cyclin D1是一個細胞周期蛋白，可促進DNA轉錄合成，使細胞由G1期進入S期，Cyclin D1過表達可促進包括皮膚鱗癌細胞在內(nèi)的多種腫瘤細胞生長[14]。BCL-2家族成員與細胞凋亡密切相關，Bax是BCL-2家族成員之一，發(fā)揮促凋亡作用，上調其表達可促進腫瘤細胞生長[15]。本實驗結果顯示，抑制PTTG基因表達可明顯下調p-AKT和Cyclin D1表達，上調Bax表達，提示沉默PTTG表達可通過抑制PI3K/AKT信號通路降低皮膚鱗癌細胞生長。LY294002是PI3K/AKT信號通路抑制劑，可抑制多種腫瘤細胞生長。本實驗結果顯示，LY294002可抑制A431細胞活力，誘導細胞凋亡，并可增加沉默PTTG表達對A431細胞活力抑制和凋亡促進作用。提示沉默PTTG表達可通過抑制PI3K/AKT信號通路降低皮膚鱗癌細胞生長。

圖6 抑制PI3K/AKT信號通路對A431細胞凋亡的影響

綜上所述，沉默PTTG基因表達可抑制皮膚鱗癌細胞活力，誘導細胞凋亡，其機制可能與提高細胞ROS水平及抑制PI3K/AKT信號通路有關。